Фотометрическое определение иммунных агрегатов

Принцип метода. Инкубация раствора антигенов с моноспецифической сывороткой приводит к образованию иммунных агрегатов. Эта разновидность иммунных комплексов рассеивает проходящий световой поток, интенсивность которого можно измерить прямо или косвенно. При турбодиметрических измерениях определяют разность ΔU между исходной величиной Uo и получаемой величиной U1 светового потока. В случае нефелометрии определяют количество света, отраженного под определенным углом к направлению падения светового потока. Интенсивность рассеянного света, или разность светового потока, прямо пропорциональна числу и величине иммунных комплексов. Соблюдая постоянные объемы реагирующих растворов, разведение сыворотки, время и температуру инкубации, можно определять концентрацию антигена в растворе при помощи калибровочной кривой. Калибровочную (стандартную) кривую получают, измеряя рассеяние света в растворах с известным содержанием антигена. На рисунке представлен ход лучей в лазерном нефелометре.

Ход лучей в лазерном нефелометре

Особая геометрия устройства позволяет улавливать свет, рассеиваемый иммунными комплексами (ИК), под очень небольшими углами. В современных лазерных нефелометрах достигается полное поглощение света, идущего в прямом направлении; этого эффекта не удается достичь с обыкновенными лампами ввиду непараллельности их лучей. Высокое постоянство излучения лазера позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты. На других факторах, влияющих на воспроизводимость (длина волны, качество фотодиодов, обусловленное кюветой рассеяния), мы не будем останавливаться, так как они влияют на методику косвенным образом. Следует упомянуть о том, что при турбидиметрических измерениях рекомендуется пользоваться по возможности коротковолновым светом, поскольку он лучше рассеивается по разным направлениям.

Особенно важно избегать при работе длины волн, совпадающие с областями поглощения гемоглобина (400—420 и 500 нм). Хорошо воспроизводимые результаты были получены нами при длине волны 450 нм.Принцип метода.

 

Материалы и оборудование.

Фосфатно-солевой буфер: 11,9 г Na2HP04-2H20 и 9,1 г NaH2P04 растворяют по отдельности в 1000 мл 0,15 М NaCl; 85,2 мл раствора Na2HP04 доводят до 100 мл раствором NaH2P04; получают буферный раствор с рН 7,5. Моноспецифическая сыворотка; стандартный раствор: стандартная сыворотка для лазерной нефелометрии с известным содержанием белка (смесь сывороток здоровых доноров, стабилизированная удалением термолабильных компонентов); фреон (C2CI3F3) для осветления мутных сывороток; центрифуга на 16 000 g; микрокюветы из синтетических материалов (кюветы Sarstedt для лазерной нефелометрии); лазерный нефелометр, например He-Ne лазерный нефелометр (Behring Werke, Марбург).

Для каждого белка строят стандартную кривую на основе 5— 6 разведений. Лучше использовать геометрический ряд разведений стандартных сывороток для лазерной нефелометрии в фосфатно-солевом буфере с рН 7,5 от 1: 10 до 1:640. Для IgG и IgA используют разведения 1:20— 1:640, для IgM и С3с — 1: 10 — 1: 160. Коммерческие препараты АС для лазерной нефелометрии обычно разводят в соотношении 1:5 (50 мкл АС + 200 мкл буфера) в сосудах, не содержащих даже следов пыли. Лучше использовать стеклянные сосуды, так как пластмассовая посуда притягивает пыль ввиду своих электростатических свойств. В измерительные кюветы вносят по 100 мкл разведенного стандартного раствора и по 200 мкл различных разведений сыворотки. В случае IgG берут только 10 мкл стандартного раствора. Образцы инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, затем проводят измерения на лазерном нефелометре. Кюветы опускают в шахту нефелометра, данные считывают с цифрового табло.