Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Простая радиальная иммунодиффузия
На плоской поверхности создают равномерный слой геля, содержащего антисыворотку. Из лунок, проштампованных в геле и заполненных раствором антигена, молекулы АГ диффундируют в гель и образуют кольца преципитации с соответствующими AT. Диаметр колец преципитации увеличивается до тех пор, пока не истощится раствор антигена. Этот метод впервые описал Манчини (Mancini) в 1963 г. Известны многочисленные модификации этого метода, мы приводим описание, основанное на методике, изложенной в монографии Mayer и Walker.
Материалы и оборудование. Для работы необходимы моноспецифические антисыворотка, стандартные препараты, контрольные сыворотки, буферные растворы, агар, рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, измерительное устройство с точностью до 0,1 мм, микро-шприцы для внесения объемов 1—10 мкл.
Последовательность этапов исследования. Растворяют 1,5 г агара в 100 мл буфера на водяной бане, охлаждают до 48 °С и смешивают с антисывороткой, желательно подогретой до той же температуры, в небольшой пропорции. Наносят пипеткой 2 мл смеси на предметное стекло, установленное строго горизонтально на подставке, нагретой до 35—40 °С. Золь агара, содержащий антитело, распределяется по поверхности предметного стекла и застывает слоем толщиной приблизительно 1 мм. Рекомендуют также наносить на предметные стекла по 1 мл горячего раствора агара (10 г/л) и высушивать их при 70 °С перед использованием. Если пластины для простой радиальной иммунодиффузии будут храниться перед употреблением в течение 2—3 недели (во влажной камере при 4°С), то к гелю добавляют консерванты (мертиолят, 0,1 г/л, азид натрия, 0,2 г/л). На предметном стекле в слое геля вырезают по 8 лунок при помощи отшлифованной стеклянной трубки, соединенной с водоструйным насосом (таким образом создают пониженное давление). В каждую из лунок вносят по 2 мкл раствора антигена. Реакцию простой радиальной иммунодиффузия проводят во влажной камере. Если линии преципитации достаточно выражены, оценку результатов можно проводить прямо на влажной пластинке. В тех случаях, когда оценку проводят немедленно, пластинки с гелем отмывают 2—3 раза в 0,15 М NaCl; каждая отмывка длится 12 часов. Этим достигается удаление непреципитировавших белков. После отмывки препараты высушивают и окрашивают, например, амидочерным 10 В. Последовательность операций представлена на рисунке:
Простая радиальная иммунодиффузия. Этапы работы
Калибровочная кривая
К моменту завершения диффузии наблюдается прямая линейная зависимость между исходной концентрацией антигена и площадью преципитата. Это можно видеть на примере графика определения IgA:
Простая радиальная иммунодиффузия. Кривая для определения IgA
D2 — квадрат диаметра диффузии
Снижая уровень антисыворотки в геле, можно последовательно увеличивать диаметр зоны преципитации. При этом К возрастает и увеличивается экономичность концентрации реагентов возможно только до определенных пределов, так как может возникнуть ослабление преципитации. В каждом отдельном случае концентрацию антисыворотки в геле подбирают в зависимости от титра антител. Обычно рекомендуют использовать 1—5% антисыворотки.
|
|||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-02-10; просмотров: 102; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.137.192.3 (0.004 с.) |