Температура и продолжительность иммунодиффузии

 

Температура существенно не влияет на результаты диффузии. Опыт можно ставить при 4°С, 20 °С или 37 °С. Обычно простую радиальную иммунодифузию проводят в холодильнике при 4—6°С с целью предупреждения роста грибов и бактерий. Следует избегать резких колебаний температуры (размах не более +5°С). Процесс иммунодиффузии при работе, например, с альбумином и ферритином, завершается через 48 ч; с IgG и IgA — через 2— 3 дня; с IgM, аг-макроглобулином и другими белками с крупными молекулами — через 5—7 дней. Первый ориентировочный замер диаметра преципитата можно получить уже через 4 ч. Существует модификация простой радиальной иммунодиффузия с постоянным временем диффузии, равным 24 часа. Это означает, что диффузия антигена по крайней мере при его высокой концентрации полностью не заканчивается. Получаемые результаты вполне сопоставимы с результатами простой линейной иммунодиффузии. Соответственно наблюдается линейная зависимость между логарифмом концентрации антигена и радиусом преципитации. Раньше считалось, что эта модификация уступает по чувствительности методу, предложенному Манчини. Недавние исследования указывают, что оба метода имеют одинаковую чувствительность.

 

Подготовка пластин для иммунодиффузии.

 

Во избежание погрешностей следует обращать особое внимание на поддержание температуры расплавленного агара при внесении антисыворотки (48°С, максимально 50°С), на правильный расчет концентрации антисыворотка в геле, на количество агара, наносимое на каждую пластину, и на строго горизонтальное расположение пластины. Поскольку толщина слоя геля уменьшается по направлению к периферии пластины, то следует добиваться того, чтобы кольца преципитации располагались не ближе 5 мм от края.

 

Значение свойств антигена.

Как правило, иммунохимические и физико-химические свойства стандартного и исследуемого антигенов должны быть сходны. Иногда это требование трудновыполнимо. Например, диффузионные свойства могут изменяться, когда молекулы антигена обладают склонностью к агрегации или, наоборот, к диссоциации. Это приводит к изменению условий диффузии, возможно даже к маскировке одних детерминант антигенов и демаскировке других. Тенденцию к агрегации можно наблюдать, в частности, в очищенных препаратах сывороточного альбумина после их повторного растворения. Если такой раствор предназначен для использования в качестве стандартного при калибровке, то агрегаты удаляют гельфильтрацией на сефадексе G-200. IgA содержится в сыворотке в виде молекул с различной степенью полимеризации. Обычно соотношение моно-, ди- и тримеров неизвестно. Приходится в данном случае ориентироваться на усредненные результаты анализов большого числа сывороток нормальных доноров или на существующие стандарты ВОЗ. В некоторых случаях завышенные результаты получаются вследствие преобладания быстро диффундирующих фрагментов (субъединиц). Это наблюдение справедливо для IgM, при работе с которым наблюдаются по меньшей мере две линии преципитации. Длительное хранение сывороток при 4°С может приводить к частичному распаду белков вследствие остаточной протеолитической активности.

 

Модификации метода.

По различным причинам в стандартную методику приходится вводить ряд изменений. Для повышения чувствительности метода используют более толстые слои геля и более вместительные лунки для антигенов (до 20 мкл). Слабые преципитаты становятся лучше различимыми после обработки танином. Танин используют в концентрациях от 0,2 до 4% при рН 1,5. Усиление действия танина наблюдается при обработке неокрашенных препаратов раствором дигидроксифениланилина. Использование подобных приемов позволяет определять даже IgE у верхней границы нормальной концентрации. Усиление преципитации наблюдается при добавлении к смеси агароза —антисыворотка карбовакса 20 М в количестве до 20 г/л. Внесение неионных полимеров (полиэтиленгликоль, карбовакс, оксидвакс) в лунки для антигена или обработка пластин для иммунодиффузия антииммуноглобулиновой сывороткой также усиливает преципитацию. Некоторые изменения при постановке простой радиальной иммунодиффузии связаны с экономией антисыворотки.

Определенное небольшое количество антисыворотки до или после диффузии антигена наносится на область предполагаемой преципитации на поверхности геля. Антиген, диффундирующие радиально, и антитела, диффундирующие соответственно вертикально, встречаются в толще геля и образуют преципитаты. При этом следует избегать подогревания геля. Простая радиальная иммунодиффузия пригодна в равной мере для количественного и для качественного анализа иммунохимически близких белков. Если количество в лунках постоянно, можно судить о титре антитела в антисыворотках различных животных по величине колец преципитации при точно известном содержании антисыворотки в геле. Для определения титра антитела смешивают гель в установленной пропорции с антигеном, антитела диффундируют в гель (так называемая обратная радиальная иммунодиффузия). Радиус колец преципитации пропорционален титру. Вместо агара или агарозы в реакции простой радиальной иммунодиффузия можно использовать пленку ацетата целлюлозы. Разработан интересный вариант данного метода, позволяющий количественно оценить степень структурного сходства родственных антигенов.

 

 

а — определение IgG на пластинах 100X70 мм (препарат д-ра Linneke, Висмар);

б — определение IgM на предметных стеклах. Два противоположных резервуара на узких сторонах стерла служат для внесения контрольной пробы.

 

Этот метод прочно удерживается в лабораториях. Многие белки можно определять, используя коммерческие наборы стандартов или даже готовые иммунодиффузионные пластинки. Ошибка метода при работе с одной серией реагентов составляет 3—7% (литературные и собственные данные). Контрольные измерения изо дня в день в течение длительного времени дают коэффициент вариации 8—10% для оценки иммуноглобулин. Известно, что в норме содержание многих сывороточных белков сильно колеблется, например IgG от 8 до 18 г/л. С учетом этого средняя ошибка определения нижних границ концентрации составляет для сывороточного IgA— 18,3%, для IgG— 17,4%, для IgM—15,7%, для гаптоглобина—13,6%, для трансферрина — 9,8%. Соответствующие значения для верхней границы составляют 8,6%, 6,5%, 7,3%, 7,1% и 5,2% (60—70 измерений последовательно в течение 26 дней).

Необходимо помнить, что концентрации ИГ, определяемые методом простой радиальной иммунодиффузия у здоровых лиц, не укладываются в нормальную кривую распределения результатов; об этом следует помнить при статистической обработке данных. Относительно простая постановка опыта, несложное оборудование, надежность метода способствуют широкому использованию простой, радиальной иммунодиффузия. К числу недостатков метода следует отнести большую длительность реакции по сравнению с другими методами, в основе которых лежит образование иммунных преципитатов. С точки зрения клиницистов, например специалистов в области клинической иммунологии, этот недостаток не столь существен, поскольку ситуации, когда необходимо знать концентрацию иммуноглобулин в день взятия пробы, встречаются редко.