Определение растворимых иммунных комплексов

Определение растворимых иммунных комплексов

Принцип метода. Экзо- или эндогенные антигены могут образовывать в организме иммунные комплексы (ИК) с соответствующими антигенами. Этот процесс может стать причиной системной или органной патологии. Судьба циркулирующих иммунных комплексов зависит от их величины и от индивидуальной активности фагоцитирующей системы. Aнтитела в составе иммунных комплексов могут включать каскад активации комплемента; кроме того, IgG- и IgM-антитела могут оказывать влияние на функции клеток, связываясь с их Fc-рецепторами. Во многих работах описано повышение концентрации циркулирующих иммунных комплексов при системных, аутоиммунных и инфекционных заболеваниях (лепра, шистосомиаз), а также при злокачественных новообразованиях. Значение анализа растворимых иммунных комплексов для постановки диагноза и понимания патогенеза еще раскрыто не до конца. Величина и состав растворимых иммунных комплексов зависят как от свойств антигенов, так и от свойств антител и в то же время от их относительной и абсолютной концентрации. В некоторых случаях в составе иммунных комплексов находили ДНК, инсулин, IgG и антигены вирусов гепатита; и все же антигенный состав иммунных комплексов, как правило, не удается охарактеризовать полностью. Специфические антигены можно обнаружить только в случае довольно ограниченного числа заболеваний. Принято считать, что иммунные комплексы, возникающие в условиях небольшого избытка антигена, представляют наибольшую опасность ввиду длительности их циркуляции и высокой комплемент активирующей способности.

Осаждение пэг

Метод основан на различной растворимости мономеров иммуноглобулин в составе иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000. Исследуемые сыворотки хранят при 4°С после добавления 0,02% азида натрия. Сыворотки разводят 0,1 М боратным буфером (рН 8,4) в соотношении 1:24. К 4 мл разведенной сыворотки добавляют равный объем 7% раствора полиэтиленгликоля 6000 в 0,1 М боратном буфере и выдерживают смесь при 4°С в течение 18 ч. После центрифугирования при 20 000 g в течение 20 минут осадок 1 раз отмывают 3,5% раствором ПЭГ, затем растворяют его в 5 мл 0,1 М NaOH. Содержание белка определяют по Лоури или по оптической плотности при длине волны 280 нм. В нормальных сыворотках преципитаты не дают значений оптической плотности более 0,12. Оценка результатов: как и в случае ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и криопреципитации, положительный ответ можно дать только после дополнительного определения IgG или Clq в сыворотках или преципитатах. Этот метод, широко применяемый в лабораториях, подвергся в последнее время критике, авторы даже объявили метод совершенно непригодным. Они полагают, что полиэтиленгликоля следует применять только для получения иммунных комплексов. которые в дальнейшем будут подвергнуты более детальному иммунохимическому анализу.

Материалы и оборудование.

Фосфатно-солевой буфер: 11,9 г Na2HP04-2H20 и 9,1 г NaH2P04 растворяют по отдельности в 1000 мл 0,15 М NaCl; 85,2 мл раствора Na2HP04 доводят до 100 мл раствором NaH2P04; получают буферный раствор с рН 7,5. Моноспецифическая сыворотка; стандартный раствор: стандартная сыворотка для лазерной нефелометрии с известным содержанием белка (смесь сывороток здоровых доноров, стабилизированная удалением термолабильных компонентов); фреон (C2CI3F3) для осветления мутных сывороток; центрифуга на 16 000 g; микрокюветы из синтетических материалов (кюветы Sarstedt для лазерной нефелометрии); лазерный нефелометр, например He-Ne лазерный нефелометр (Behring Werke, Марбург).

Для каждого белка строят стандартную кривую на основе 5— 6 разведений. Лучше использовать геометрический ряд разведений стандартных сывороток для лазерной нефелометрии в фосфатно-солевом буфере с рН 7,5 от 1: 10 до 1:640. Для IgG и IgA используют разведения 1:20— 1:640, для IgM и С3с — 1: 10 — 1: 160. Коммерческие препараты АС для лазерной нефелометрии обычно разводят в соотношении 1:5 (50 мкл АС + 200 мкл буфера) в сосудах, не содержащих даже следов пыли. Лучше использовать стеклянные сосуды, так как пластмассовая посуда притягивает пыль ввиду своих электростатических свойств. В измерительные кюветы вносят по 100 мкл разведенного стандартного раствора и по 200 мкл различных разведений сыворотки. В случае IgG берут только 10 мкл стандартного раствора. Образцы инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, затем проводят измерения на лазерном нефелометре. Кюветы опускают в шахту нефелометра, данные считывают с цифрового табло.

 

Проведение электрофореза

Электрофоретическую камеру присоединяют к источнику постоянного тока, выдерживающего нагрузку до 100 мА. Электродные отсеки заполняют веронал-ацетатным буфером с рН 8,6 и устанавливают камеру строго горизонтально по уровню.

Внесение антисыворотки

После электрофоретического разделения белков в продольную канавку вносят 0,03—0,05 мл преципитирующей иммунной сыворотки. Сыворотка не должна переливаться через край канавки, иначе расположение линий преципитации будет искажено.

Гели и их свойства.

Основная функция геля — локализация преципитата. Она становится возможной, если растворенные антигены и антитела легко диффундируют в геле, но образующиеся иммунные комплексы ввиду их величины остаются внутри ячеек геля. Благодаря локализации преципитата достигается следующее:

а. В множественных системах антиген-антитело отдельные компоненты реакции диффундируют с различной скоростью, обусловленной неодинаковой величиной молекул и их концентрацией. В связи с этим могут образовываться множественные пространственно разделенные преципитаты, т. е. создается возможность анализа множественных систем.

б. По форме и расположению преципитатов можно судить о диффузионных свойствах и, следовательно, об относительной молекулярной массе антигена или антитела.

в. Порядок расположения линий преципитации по отношению друг к другу позволяет делать выводы об полном или частичном иммунохимическом сходстве, а также об отсутствии такового.

г. Исходя из величины ареала и удаленности от линии старта иммунных комплексов, можно проводить их количественное определение.

 

Наиболее распространены гели агара и агарозы; гели желатины, пектина, крахмала, полиакриламида или ацетата целлюлозы применяются в реакциях иммунодиффузии реже.

Подготовка пластин для иммунодиффузии.

 

Во избежание погрешностей следует обращать особое внимание на поддержание температуры расплавленного агара при внесении антисыворотки (48°С, максимально 50°С), на правильный расчет концентрации антисыворотка в геле, на количество агара, наносимое на каждую пластину, и на строго горизонтальное расположение пластины. Поскольку толщина слоя геля уменьшается по направлению к периферии пластины, то следует добиваться того, чтобы кольца преципитации располагались не ближе 5 мм от края.

 

Значение свойств антигена.

Как правило, иммунохимические и физико-химические свойства стандартного и исследуемого антигенов должны быть сходны. Иногда это требование трудновыполнимо. Например, диффузионные свойства могут изменяться, когда молекулы антигена обладают склонностью к агрегации или, наоборот, к диссоциации. Это приводит к изменению условий диффузии, возможно даже к маскировке одних детерминант антигенов и демаскировке других. Тенденцию к агрегации можно наблюдать, в частности, в очищенных препаратах сывороточного альбумина после их повторного растворения. Если такой раствор предназначен для использования в качестве стандартного при калибровке, то агрегаты удаляют гельфильтрацией на сефадексе G-200. IgA содержится в сыворотке в виде молекул с различной степенью полимеризации. Обычно соотношение моно-, ди- и тримеров неизвестно. Приходится в данном случае ориентироваться на усредненные результаты анализов большого числа сывороток нормальных доноров или на существующие стандарты ВОЗ. В некоторых случаях завышенные результаты получаются вследствие преобладания быстро диффундирующих фрагментов (субъединиц). Это наблюдение справедливо для IgM, при работе с которым наблюдаются по меньшей мере две линии преципитации. Длительное хранение сывороток при 4°С может приводить к частичному распаду белков вследствие остаточной протеолитической активности.

 

Модификации метода.

По различным причинам в стандартную методику приходится вводить ряд изменений. Для повышения чувствительности метода используют более толстые слои геля и более вместительные лунки для антигенов (до 20 мкл). Слабые преципитаты становятся лучше различимыми после обработки танином. Танин используют в концентрациях от 0,2 до 4% при рН 1,5. Усиление действия танина наблюдается при обработке неокрашенных препаратов раствором дигидроксифениланилина. Использование подобных приемов позволяет определять даже IgE у верхней границы нормальной концентрации. Усиление преципитации наблюдается при добавлении к смеси агароза —антисыворотка карбовакса 20 М в количестве до 20 г/л. Внесение неионных полимеров (полиэтиленгликоль, карбовакс, оксидвакс) в лунки для антигена или обработка пластин для иммунодиффузия антииммуноглобулиновой сывороткой также усиливает преципитацию. Некоторые изменения при постановке простой радиальной иммунодиффузии связаны с экономией антисыворотки.

Определенное небольшое количество антисыворотки до или после диффузии антигена наносится на область предполагаемой преципитации на поверхности геля. Антиген, диффундирующие радиально, и антитела, диффундирующие соответственно вертикально, встречаются в толще геля и образуют преципитаты. При этом следует избегать подогревания геля. Простая радиальная иммунодиффузия пригодна в равной мере для количественного и для качественного анализа иммунохимически близких белков. Если количество в лунках постоянно, можно судить о титре антитела в антисыворотках различных животных по величине колец преципитации при точно известном содержании антисыворотки в геле. Для определения титра антитела смешивают гель в установленной пропорции с антигеном, антитела диффундируют в гель (так называемая обратная радиальная иммунодиффузия). Радиус колец преципитации пропорционален титру. Вместо агара или агарозы в реакции простой радиальной иммунодиффузия можно использовать пленку ацетата целлюлозы. Разработан интересный вариант данного метода, позволяющий количественно оценить степень структурного сходства родственных антигенов.

 

 

а — определение IgG на пластинах 100X70 мм (препарат д-ра Linneke, Висмар);

б — определение IgM на предметных стеклах. Два противоположных резервуара на узких сторонах стерла служат для внесения контрольной пробы.

 

Этот метод прочно удерживается в лабораториях. Многие белки можно определять, используя коммерческие наборы стандартов или даже готовые иммунодиффузионные пластинки. Ошибка метода при работе с одной серией реагентов составляет 3—7% (литературные и собственные данные). Контрольные измерения изо дня в день в течение длительного времени дают коэффициент вариации 8—10% для оценки иммуноглобулин. Известно, что в норме содержание многих сывороточных белков сильно колеблется, например IgG от 8 до 18 г/л. С учетом этого средняя ошибка определения нижних границ концентрации составляет для сывороточного IgA— 18,3%, для IgG— 17,4%, для IgM—15,7%, для гаптоглобина—13,6%, для трансферрина — 9,8%. Соответствующие значения для верхней границы составляют 8,6%, 6,5%, 7,3%, 7,1% и 5,2% (60—70 измерений последовательно в течение 26 дней).

Необходимо помнить, что концентрации ИГ, определяемые методом простой радиальной иммунодиффузия у здоровых лиц, не укладываются в нормальную кривую распределения результатов; об этом следует помнить при статистической обработке данных. Относительно простая постановка опыта, несложное оборудование, надежность метода способствуют широкому использованию простой, радиальной иммунодиффузия. К числу недостатков метода следует отнести большую длительность реакции по сравнению с другими методами, в основе которых лежит образование иммунных преципитатов. С точки зрения клиницистов, например специалистов в области клинической иммунологии, этот недостаток не столь существен, поскольку ситуации, когда необходимо знать концентрацию иммуноглобулин в день взятия пробы, встречаются редко.

 

Оценки результатов.

Количество линий преципитации. Во множественных системах всегда существует вероятность того, что два или более комплекса антиген-антитело вследствие одинаковой скорости диффузии будут образовываться в одном и том же участке геля, формируя, следовательно, одну линию преципитации. Кроме того, концентрация антител и антигенов или соотношение компонентов реакции может быть настолько неблагоприятным, что видимые преципитаты не будут образовываться. Поэтому число видимых линий преципитацпи, как правило, меньше числа систем антиген-антитело или в лучшем случае равно ему.

Расположение преципитатов между лунками. При оптимальном соотношении между антигенами и антителами после окончания диффузии линия преципитации располагается примерно на середине расстояния между лунками. Если один из компонентов реакции присутствует в большем количестве, чем другой, то линия преципитации сдвигается в сторону лунки с меньшим содержанием реагента. Если соотношение концентраций реагентов может измениться в месте первичного выпадения предметов, например, вследствие избыточного поступления одного из компонентов, это приводит к смещению линии преципитации. Часть иммунных агрегатов, особенно в зоне избытка антител, может оставаться на старом месте в виде вуали и расширения линии преципитации. Именно возможность возникновения таких процессов обусловливает необходимость ежедневных проверок пластин геля при длительно протекающей иммунодиффузии. Взаимное расположение линий (сравнительный анализ). Для выявления полной или частичной идентичности обычно располагают лунки в углах треугольника, в две помещают растворы сравниваемых антигенов, в третью — антисыворотку. Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации:

1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это говорит об идентичности обоих антигенов.

2. Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реагирующие с антисывороткой детерминанты антигены неидентичны и, следовательно, сами антигены различны.

3. Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой "шпоры". "Шпора" часто бывает тоньше основной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с антигенами сливается с первой линией. Это означает, что оба антигена обладают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответствующими антителами иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из антигенов имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответствующих антител в антисыворотке приводит к образованию "шпоры".

4. Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются одновременно. Это означает, что оба антигена содержат как одинаковые, так и различные детерминанты, которые вступают в реакцию с антителами полиспецифической антисыворотки.

 

Основные типы преципитации представлены на рисунке:

Расположение линий преципитации при сравнительных исследованиях методом двойной радиальной иммунодиффузии

а — 1—4 варианты преципитации; б — анализ органоспецифических антигенов. В центре— антисыворотка к экстракту почек (АСЭП): ЭП — экстракт почек; СЧ— сыворотка человека. В сыворотке человека и в экстракте почек присутствует один общий антиген (идентичная реакция). Второй антиген присутствует только в экстракте почек (перекрестная реакция с первым аг) (препарат проф. Friemel)»

Модификация метода.

Вышеописанная методика иммунодиффузии на предметных стеклах представляет собой микровариант метода, предложенного Ухтерлони в 1949 г. В условиях макрометода слой геля, создаваемый в чашках Петри, составляет 2—3 мм, лунки и соответственно объемы реагентов довольно велики, лунки отодвинуты друг от друга на значительные расстояния, линии преципитации длинные и хорошо выраженные.

Титрование. Для титрования растворов антигенов или антисывороток располагают лунки так, как показано на рисунке:

Двойная радиальная иммунодиффузия. Титрование раствора антигена (титр 1: 16)

Одинаковые объемы растворов антигена, приготовленных двукратным разведением, вносят в периферические лунки. Такой же объем антисыворотки вносят в центральную лунку. При оценке иммунодиффузии учитывают:

1. Расстояние от линии преципитации до центральной и периферической лунок.

2. Наибольшее разведение антигена, при котором еще заметно образование преципитата.

3. Интенсивность и ширину полос преципитации. Наибольшее разведение, при котором еще образуются видимые преципитаты, дает значение титра. Этим способом можно также определять количество преципитирующих антител в различных антисыворотках, которые, например, можно сравнивать в реакции иммунодиффузии со стандартным раствором антигенов.

 

Полуколичественное определение антигенов. Титрование часто используют для полуколичественного определения антигена. Вокруг центральной лунки с антисывороткой формируют четыре лунки для антигена. Чем выше концентрация антигена, тем ближе к центральной лунке будут расположены полосы преципитации. Путем сравнения со стандартным раствором антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена в исследуемой пробе.

Оценка метода

 

Двойная радиальная иммунодиффузия представляет собой прежде всего метод количественного анализа. Ее применяют для определения количества антигена в жидкостях (сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, экстракты тканей). Ее также применяют для проверки чистоты препаратов, при получении антисывороток животных и оценке эффективности иммунизации. Титрование и полуколичествеиное определение антигенов расширяет возможности применения метода. Определение отдельных антигенов в многокомпонентных растворах требует применения моноспецифических антисывороток. Метод двойной радиальной иммунодиффузии можно использовать также для анализа трудно-растворимых субстанций, таких, как кератин и прокератин, с условием предварительной их солюбилизации ДСН, гуанидин-хлоридом (до 6 М), мочевиной (до 8 М). После солюбилизации эти вещества продолжают реагировать с соответствующими антителами в геле агарозы.

 

Темы рефератов

 

1. Антитела. Их свойства, молекулярная структура.

2. Классы иммуноглобулинов, субклассы, аллотипы, идиотипы.

3. Биологические функции иммуноглобулинов разных классов.

4. Синтез молекул иммуноглобулинов в организме. Динамика выработки антител. Метаболизм иммуноглобулинов.

5. Реакция антиген-антитело, молекулярная основа, фазы и варианты взаимодействия.

6. Биологические эффекты реакции антиген-антитело.

7. Реакция преципитации, разновидности, практическое применение, примеры.

8. Какими способами можно определить иммуноглобулины в сыворотке крови?

9. Структура и функции бета-лизинов.

10. Структура и функции лизоцима.

11. Иммуноферментный анализ.

 

Определение растворимых иммунных комплексов

Принцип метода. Экзо- или эндогенные антигены могут образовывать в организме иммунные комплексы (ИК) с соответствующими антигенами. Этот процесс может стать причиной системной или органной патологии. Судьба циркулирующих иммунных комплексов зависит от их величины и от индивидуальной активности фагоцитирующей системы. Aнтитела в составе иммунных комплексов могут включать каскад активации комплемента; кроме того, IgG- и IgM-антитела могут оказывать влияние на функции клеток, связываясь с их Fc-рецепторами. Во многих работах описано повышение концентрации циркулирующих иммунных комплексов при системных, аутоиммунных и инфекционных заболеваниях (лепра, шистосомиаз), а также при злокачественных новообразованиях. Значение анализа растворимых иммунных комплексов для постановки диагноза и понимания патогенеза еще раскрыто не до конца. Величина и состав растворимых иммунных комплексов зависят как от свойств антигенов, так и от свойств антител и в то же время от их относительной и абсолютной концентрации. В некоторых случаях в составе иммунных комплексов находили ДНК, инсулин, IgG и антигены вирусов гепатита; и все же антигенный состав иммунных комплексов, как правило, не удается охарактеризовать полностью. Специфические антигены можно обнаружить только в случае довольно ограниченного числа заболеваний. Принято считать, что иммунные комплексы, возникающие в условиях небольшого избытка антигена, представляют наибольшую опасность ввиду длительности их циркуляции и высокой комплемент активирующей способности.

Осаждение пэг

Метод основан на различной растворимости мономеров иммуноглобулин в составе иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000. Исследуемые сыворотки хранят при 4°С после добавления 0,02% азида натрия. Сыворотки разводят 0,1 М боратным буфером (рН 8,4) в соотношении 1:24. К 4 мл разведенной сыворотки добавляют равный объем 7% раствора полиэтиленгликоля 6000 в 0,1 М боратном буфере и выдерживают смесь при 4°С в течение 18 ч. После центрифугирования при 20 000 g в течение 20 минут осадок 1 раз отмывают 3,5% раствором ПЭГ, затем растворяют его в 5 мл 0,1 М NaOH. Содержание белка определяют по Лоури или по оптической плотности при длине волны 280 нм. В нормальных сыворотках преципитаты не дают значений оптической плотности более 0,12. Оценка результатов: как и в случае ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и криопреципитации, положительный ответ можно дать только после дополнительного определения IgG или Clq в сыворотках или преципитатах. Этот метод, широко применяемый в лабораториях, подвергся в последнее время критике, авторы даже объявили метод совершенно непригодным. Они полагают, что полиэтиленгликоля следует применять только для получения иммунных комплексов. которые в дальнейшем будут подвергнуты более детальному иммунохимическому анализу.