Пояснити суть ряду методів визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків ( дифузійних, Е-тесту, стріпів, серійних розведень).

Існує кілька стандартних тестів на чутливість мікроорганізмів до антибіотиків.

Дифузійний метод.Антибіотик дифундує від точки нанесення, і чим далі від неї тим нижча його концентрація в агарі. Чутливий до антибіотика організм зупинить свій ріст на великій відстані від джерела дифузії, створивши зону затримки росту великого діаметру. Чим менша чутливість мікроорганізму, тим більша концентрація антибіотика потрібна, щоб зупинити його ріст, і тим менший діаметр зони затримки росту. Нечутливі до антибіотика мікроорганізми таку зону не утворюють взагалі.

Метод дисків. На даний час замість класичного дифузійного методу застосовують метод дисків. Після посіву досліджуваної культури на агар наносять диски з фільтрувального паперу, просочені різними антимікробними препаратами. Після інкубації при 37*С протягом часу,необхідного для росту виділеного збудника, проводять визначення діаметру зони затримки росту.

Метод серійних розведень.Методи серійних розведень у рідких середовищах дозволяють встановити Мінімальну інгібуючи концентрацію(МІК), яка відповідає найбільшому розведенню препарату, що гальмує ріст тест-культури, і Мінімальну бактерицидну концентрацію(МБК), яка визначається внесенням у контрольні пробірки з рідким пож. Середовищем по 0,01 мл середовища з кожної пробірки ряду розведень. Після інкубації протягом 18-20 год. Виявляють найменшу дозу препарату, що надає бактерицидний ефект.

Е-Тест являє собою кількісний метод визначення МІК протигрибкових та антибактеріальних препаратів для інфекційних агентів, в тому числі септичних, що особливо важливо для важких хворих. У цьому методі зараз налічується 100 з гаком антибіотиків для тестування ряду аеробних бактерій і вибагливих організмів, таких як пневмококи, гемофільні мікроорганізми, H.pylori, менінгококи, гонококи, анаеробні, гриби, і мікобактерії.

Метод стріпів такий як і метод дисків, але там використовують стріпи.

Вибрати антибіотики, механізм дії яких полягає у пригніченні синтезу білка у бактеріальних клітинах, а також у впливі на цитоплазматичну мембрану бактеріальних клітин, пригніченні синтезу клітинної стінки, пригніченні синтезу нуклеїнових кислот.

Інгібітори синтезу білка: аміноглікозиди, тетрацикліни, левоміцетин (хлорамфенікол), макроліди, азаліди,лінкозаміди.

Аміноглікозиди 1 покоління: стрептоміцин,канаміцин, мономі цин, неоміцин.

Аміноглікозиди 2 покоління: гентаміцин.

Аміноглікозиди 3 поколіня: сизоміцин, тобраміцин, амікацин, нетилміцин, дидезоксиканаміцин В.

Тетрацикліни: доксициклін, міноциклін, хлор тетрациклін, окситетрациклін, тетрациклін.

Макроліди: еритроміцин, олеандоміцин, спіраміцин, рокситроміцин, диритроміцин, кларитроміцин, длуритроміцин.

Азаліди: азитроміцин(торгові марки «сума мед» і «цитромакс»)

Лінкозаміди: лінкоміцин.

Інгібітори синтезу нуклеїнових кислот:Рифаміцин.

Інгібітори синтезу клітинної стінки:

Пеніциліни: 1 покоління(метицилін, оксацилін, клоксацилін,нафіцилін), 2 і 3 покоління(карбоксипеніциліни) 4 покоління (мециліни), вузького спектра дії(метицилін, оксацилін, клоксацилін, флуклоксацилін), широкого спектра дії (ампіцилін, амоксициін, півампіцилін, талампіцилін) і ін.

Цефалоспорини:1 покоління(цефазолін, цефалотин,цефалексин, цефрадин, цефапірин, цефадроксил), 2 покоління(цефуроксим, цефопситин, цефаклор, цефоранід), 3 покоління(цефотаксим, цефтріаксон,цефперазон, цефіксимін)

В-лактамні антибіотики(азтреонам, іміпенем)

Бацитрацини(бацитрацин А)

Ванкоміцин

Циклосерин

Порушують функції цитоплазматичної мембрани:

Поліміксини

Полієнові антибіотики(ністатин, леворин, амфорицин В)

Граміцидини

Вибрати серед хіміотерапевтичних засобів препарати, що належать до сульфаніламідів, фторхінолонів, гідразидів ізонікотинової кислоти, імідазольних та триазольних похідних.пояснити механізм і спектр дії цих препаратів.

Сульфаніламіди Сучасні сульфаніламідні препарати мають спільний спектр і механізм протимікробної дії. Вона ґрунтуєтся на конкурентному антагонізмі сульфаніламідних засобів і параамінобензойної кислоти. Вплив сульфаніламідних засобів і параамонібензойної кислоти на життєдіяльність мікроорганізмів є прямо протилежним.

препарати короткої дії — до 8 год. (сульфадимезин, етазол, етазол-натрій, уросульфан, сульфацил-натрій);

препарати середньої тривалості дії — 8-16 год. (сульфадіазин, сульфаметоксазол, сульфаметрол);

препарати тривалої дії — 24-28 год. (сульфадиметоксин, сульфаметрол);

препарати надтривалої дії — понад 7 днів (сульфален).

Фторхінолони Фторхінолони діють бактерицидно, порушуючи синтез ДНК в бактеріальних клітинах, блокуючи два життєво важливих ферменти бактерій — ДНК-гіразу та топоізомеразу. Препарати цієї групи діють на мікроорганізми не тільки в період росту. Фторхінолони мають не тільки антибактеріальну дію, а крім цього постантибіотичний ефект та імуномодулюючу дію.

I покоління — (оксихінолони) — Ціноксацин, Налідиксова кислота, Оксолінова кислота, Піромідієва кислота, Піпемідова кислота, Розоксацин.

II покоління — Норфлоксацин, Ципрофлоксацин, Еноксацин, Флероксацин, Ломефлоксацин, Надіфлоксацин, Офлоксацин, Пефлоксацин, Руфлоксацин.

III покоління — Балофлоксацин, Грепафлоксацин, Левофлоксацин, Пазуфлоксацин, Спарфлоксацин, Темафлоксацин, Тосуфлоксацин.

IV покоління — Клінафлоксацин, Гатіфлоксацин, Моксифлоксацин, Геміфлоксацин, Ситафлоксацин, Тровафлоксацин, Пруліфлоксацин, Безифлоксацин.

Гідразиди ізонікотинової кислоти Ізоніазид - найефективніший з препаратів ГИНК при будь-якій формі і локалізації активного туберкульозу як у дорослих, так і у дітей.

6)для лабораторних досліджень використовують кров і ліквор хворих, а також вміст пухирців, біоптати шкіри, виділення з носоглотки. З допомогою мікроскопа в мазках з вмісту пухирців виявляють багатоядерні клітини з еозинофільними включеннями в ядрі. Вдаються також доімунофлюоресцентного фарбування клітин, взятих з основного шару шкіри. Для культивування вірусу придатні фібробласти шкірно-м’язової тканини та епітеліальні клітини ембріона людини.виявляється поліморфний бпгатоядерний синцитій з тільцями Каудрі.

7) Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

Пробірки або пластини інкубують протягом 1-3 год при тій самій температурі до повного осідання еритроцитів і оцінюють результати. Реакцію вважають позитивною при відсутності аглютинації еритроцитів.

8)особливість діагностики полягає у виявленні ат до збудника,а в динаміці- виявлення зростання титру специфічних ат на початку і вкінці хвороби.ат виявляють у парних сироватках.першу пробу беруть на початку хвороби,другу вкінці,тлбто через 2 тижні,сироватки позбавляють вірусних інгібіторів.реакція вважається позитивна,якщо титр збільшився у 4 і більше разів

9) можна використати для постановки реакції інші живі системи – курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компонентами реакції є вірусмісткий матеріал (культуральна рідина, інфіковані або дезінтегровані культури клітин), імунна противірусна сироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають залежно від біологічних властивостей вірусів. Найчастіше використовують культури клітин HeLa, СМЦ, нирок мавп, первинні культури клітин курячих чи людських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, попередньо готують послідовні десятикратні розведення від 10-1 до 10-8. По 0,1 мл кожного розведення вносять у пробірки, в яких знаходиться культура клітин. Перед проведенням досліду в пробірках замінюють живильне середовище. Як правило, заражують по три пробірки з культурою клітин для кожного розведення вірусмісткого матеріалу. Контролем є культури клітин, які не інфікують вірусом. Клітинні культури інкубують при 37 °С протягом 5-7 днів. Результати оцінюють за наявністю або відсутністю цитопатичної дії. Визначають 50 % тканинну цитопатичну дію вірусів (ТЦД50), тобто найбільше розведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50 % заражених клітин.

В основному досліді використовують пробірки із розведеннями імунної сироватки.Систему інкубують при 37 °С протягом одного тижня і враховують наявність цитопатичного ефекту. Відсутність його свідчить про нейтралізацію вірусу, який вивчається, специфічною імунною сироваткою. За ідентичною схемою реакцію можна ставити в спеціальних полістиролових планшетах.

Кольорова проба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою клітин останні гинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не змінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин. Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого утворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в кислу сторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного (лужне рН) на солом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл досліджуваного вірусмісткого матеріалу, який містить 100 ТЦД50, з різними розведеннями специфічної противірусної імунної сироватки. Після 30-60-хвилинної інкубації при температурі 37 °С у пробірки додають по 0,25 мл клітинної суспензії з індикатором фенолротом і заливають їх шаром вазелінової олії або закривають резиновими корками. Пробірки витримують у термостаті при 37 °С протягом одного тижня, а потім читають результати. При позитивному тесті в дослідних пробірках спостерігають зміну кольору індикатора з червоного на оранжевий.

Оцінити результати реакції можна також безпосередньо вимірюючи значення рН середовища за допомогою іономера. Кольорову пробу особливо часто використовують для лабораторної діагностики поліомієліту.

10) Світлооптичному МІКРОСКОПІЯ

Темнопольна мікроскопія дозволяє спостерігати живі бактерії. Для цього використовують темнопольний конденсор, що виділяє контрастують структури незабарвленого матеріалу. Перед початком роботи світло встановлюютьцентрують по світлому полю, потім светлопольний конденсор видаляють і замінюють відповідноюсистемою (наприклад, ОІ-10 або ОІ-21). Препарат готують за методом «роздавленої краплі», роблячи його як можна більш тонким (товщина покривного скла не повинна бути товщі за 1 мм). Спостережуваний об'єкт виглядає як освітлений на темному полі. При цьому промені від освітлювача падають на об'єкт збоку, а в лінзи мікроскопа надходять тільки розсіяні промені (рис. 1-2). Як імерсійної рідини придатне вазелінове масло.

Фазово-контрастна мікроскопія дозволяє вивчати живі і нефарбовані об'єкти за рахунок підвищення їх контрастності. При проходженні світла через забарвлені об'єкти відбувається зміна амплітуди світлової хвилі, а при проходженні через незабарвлені - фази світлової хвилі, що використовують для отримання висококонтрастного зображення у фазово-контрастної (рис. 1-3) та інтерференційної мікроскопії. Для підвищення контрастності фазові кільця покривають металом, що поглинає пряме світло, не впливаючи на зсув фази. В оптичній системі мікроскопа застосовують спеціальний конденсор з револьвером діафрагм і центрувальним пристроєм; об'єктиви замінюють на імерсійним об'єктиви-апохромати.

Поляризаційна мікроскопія дозволяє отримувати зображення нефарбованих анізотропних структур (наприклад, колагенових волокон, міофібрил або клітин мікроорганізмів). Принцип методу заснований на вивченні об'єкта у світлі, утвореному двома променями, поляризованими у взаємно перпендикулярних площинах.

Інтерференційна мікроскопія поєднує принципи фазово-контрастної і поляризаційної мікроскопії. Метод застосовують для отримання контрастного тривимірного зображення нефарбованих об'єктів. Принцип методу заснований на роздвоєнні світлового потоку в мікроскопі; один промінь проходить через об'єкт, інший - повз нього. Обидва промені з'єднуються в окулярі і інтерферують між собою.

Люмінесцентна мікроскопія. Метод заснований на здатності деяких речовин світитися при дії короткохвильового випромінювання. При цьому випускаються світлові хвилі довше хвилі, що викликає світіння. Іншими словами, флюоресцирующим об'єкти поглинають світло

1. 11 Облік реакції ІФА, поставленго з метою виявлення противірусних антитіл окремих класів.Інтерпритувати результат дослідження

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ферментом-Зразок, у якому хочуть виявити специфічну молекулу або мікроорганізм, фіксують на планшетці

-До фіксованого зразка додають антитіло, специфічне до маркерної молекули (первинне антитіло), потім промивають лунку, щоб видалити молекули первинного антитіла, які не зв'язалися;

-Додають вторинне антитіло, що специфічно зв'язується з первинним і не взаємодіє з маркерною молекулою. До цього антитіла приєднаний фермент (наприклад, лужна фосфатаза, пероксидазаабо уреаза), що може каталізувати перетворення незабарвленого субстрату в забарвлений продукт. Промивають лунку, щоб видалити молекули, які не зв'язалися;

Додають незабарвлений субстрат, що впізнається та утилізується ферментом;

Проводять якісне або кількісне визначення пофарбованого продукту

Твердофазні імуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в наступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджувану сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають субстрат для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчастіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики специфічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є модифікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.