Методи цитоембріології рослин.

Цитоембріологія вивчає мікроскопічні структури, що можливе тільки при використанні мікроскопічних методів.

Метод світлової мікроскопії – основний метод, який застосовують цитоембріологи.

Вивчення фіксованих клітин. Фіксація - перший і надзвичайно важливий спосіб, необхідний для одержання постійних препаратів.

Після фіксації матеріал промивають спиртом (при використанні спиртових фіксаторів) або водою. Матеріал обезводнюють в спиртах із зростаючою концентрацією. В подальшому спирт замінюють парафінорозчинником, найчастіше - ксилолом (або толуолом, хлороформом). Ксилол замінюють парафіном. Таким чином, фіксований матеріал просочується парафіном і придатний для різання на мікротомі. Зрізи наклеюють на предметні скельця (куриний білок+гліцерин). В подальшому, препарати звільняють від парафіна і фарбують.

Для фарбування фіксованих тканин застосовують натуральні фарбники (гематоксилін, кармін та ін.), які використовують у сполученні із протравами (4% розчин залізо-амонійних квасців). При використанні фарбників збільшується чіткість морфологічних картин і можна отримати відомості про хімізм тої чи іншої структури.

 

Світлова мікроскопія.

Найбільш важливою властивістю світлового мікроскопа, як оптичного приладу, є роздільна здатність – найменша відстань між двома точками „d".

d = 0,61x (λ / n sin α)

де (λ – довжина хвилі світла, використаного для освітлення об'єкту; n – коефіцієнт заломлення середовища; α - кут між оптичною віссю об'єктива і найбільш відхиленим променем, що входить в об'єктив. Основним фактором, що обмежує роздільну силу світлового мікроскопа, є довжина світлової хвилі. При оптимальних умовах і максимальній контрастності об'єкта розмір структури, яку можна бачити в мікроскоп, рівний півхвилі видимого світла (0,2 мкм). Якщо використати ультрафіолетове світло, то можна збільшити роздільну здатність до 0,13-0,14 мкм. Таким чином, межа підвищення роздільної здатності мікроскопа, у порівнянні з нашим оком, складає 100 мкм. Така межа можливостей світлового мікроскопа не дозволяє спостерігати всі клітинні структури. Зараз, у пошуках збільшення роздільної здатності, досягнуті певні успіхи. Сконструйовані певні пристосування до звичайною мікроскопа (темне поле, фазовий контраст) і створені нові мікроскопи - ультрафіолетовий, флуоресцентний, поляризаційний і інтерференційний.

 

Електронна мікроскопія.

Електронна мікроскопія досліджує субмікроскопічну структуру клітини. Джерело освітлення - катод електронної пушки, конденсорна система - конденсорна лінза; об'єктив - об'єктивна лінза; окуляр – проекційна лінза; люмінесцентний екран або фотопластинка. Основна частина мікроскопа - пустий циліндр, у якому створено вакуум для проходження електронів. Для прискорення електронів між катодом і анодом подається висока напруга (50-500 кВ). В електронному мікроскопі роль лінз виконують електромагніти, які фокусують пучок електронів. Об'єкт розглядають на екрані або фотографують. Практично всі електрони, що проходять через об'єкт, мають однакову довжину хвилі.

Різні ділянки об'єкта відрізняються за ступенем розсівання електронів і на фотопластинці дають чорно-біле забарвлення. В сучасних електронних мікроскопах досягається роздільна здатність 1 Ангстрем при теоретично можливій - 0,025. Якщо підсумувати збільшення електронного мікроскопа (500.000 раз) і збільшення, одержане при фотодрукові (10 разів), то кінцеве збільшення може сягати 106 разів.

Внаслідок низької контрастності біологічних об'єктів, щоб отримати таку роздільну здатність, застосовують контрастування біологічних об'єктів. Поширеним методом для цього є відтінення металами (платина, уран, паладій та ін.) та розчинами солей важких металів - уранілацетатом, молібденово-кислим, амонієм. Біологічні об'єкти для дослідження розташовують на мідних сіточках, покритих тонкими плівками-підніжками (колодій, вуглець).

В електронному мікроскопі можна досліджувати тільки тонкі об'єкти - не товщі 0,1 мкм. Для цього використовують ультрамікротоми з термічною подачею. Зріз виготовляють ножем із скла (скол скла). Товщина зрізів - від 0,05 до 0,12 мкм.

 

Цитохімія.

Дослідженнями, що спрямованими на виявлення специфічних речовин і характеру розподілу їх у клітині займається цитохімія. При цитоембріологічних дослідженнях важливо одержати дані про локалізацію речовин у клітині.

Завдання цитохімії не обмежуються тільки якісним аналізом. Велике значення має кількісний аналіз речовин у клітині під час її функціонування. Розроблено методи цитохімічного функціонування основних речовин, які входять до складу структур клітини (білків, нуклеїнових кислот, вуглеводів, ферментів і т.д.). При цитохімічному визначенні речовин необхідно враховувати дві основні умови: специфічність фарбника і сталість локалізації речовин.

Найкращим прикладом такої реакції є реакція Фельгена для виявлення ДНК. Відомо, що до складу ДНК входять залишки фосфорної кислоти, цукор (£-дезоксирибоза) і азотисні основи. Дезоксирибоза в ході гідролізу з соляною кислотою перетворюється в альдегід, який при взаємодії з фуксин-сернистою кислотою (реактив Шиффа) зафарбовується в червонувато-фіолетовий колір. Таким чином, реакція Фельгена складається з 2-х етапів: гідролізу і зафарбовування. Зв'язок фарбника, у даному випадку, кількісний. Кількість продукту цитофотометричної реакції визначають за допомогою цитофотометрії (цитофотометрія (від цито..., фото... і...метрія) - один з методів кількісної цитохімії, що дозволяє визначати хімічний склад клітин у гістологічному препараті за поглинанням світла клітинами) за поглинанням речовиною світла певної довжини хвилі. Інтенсивність поглинання променів пропорційна концентрації речовини. Якщо відома площа або обсяг структури, що вимірюється і значення поглинання, можна визначити концентрацію і абсолютний вміст речовини. Для визначення кількості ДНК, після реакції Фельгена, необхідно: виявити вміст фуксина, який зафарбовує ДНК у червоний колір, кількість якого прямопропорційна вмісту ДНК.

Кількість нуклеїнових кислот і білків у клітині визначають методом ультрафіолетової цитофотометрії, яка базується на тому, що різні речовини поглинають ультрафіолет у різних ділянках спектра. Кількість речовин визначають за поглинанням у специфічній зоні ультрафіолетового спектра.

2.4. Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія.

Базується на тому, що багато речовин, при опроміненні короткохвильовими променями, переходять у стан збудження, поглинаючи енергію цих променів. Речовини, що збуджуються, дають оптичне випромінювання.

Використовуючи методи кількісної флуорометрії, можна визначити вміст речовин у клітині. Наприклад, флуорохром акридиловий оранжевий вибірково зв'язується з нуклеїновими кислотами. Із ДНК він зв'язується в мономерній формі і флуоресціює зеленим світлом, із РНК у химерній формі і флуоресціює червоним світлом. За ступенем свічення визначають кількість речовин, з якими зв'язуються флуорохроми.

Метод люмінесцентного аналізу має важливе значення для визначення фізико-хімічного стану нуклеїнових кислот. Препарати попередньо обробляють так, щоб усунути ліпіди і РНК або ацетилувати гістони, що дає можливість встановити зв'язок нуклеїнових кислот з білками і ліпідами, визначити їх структурний стан в хроматині ядер.

Для з'ясування місць синтезу біополімерів і динаміки синтетичних процесів використовують метод авторадіографії, який базується на використанні мічених радіоактивними ізотопами речовин.

На препарати тканин рослин, у які були введені радіоактивні ізотопи, накладають фотоемульсію. Після певної експозиції ці препарати проявляють і знаходять на них місця локалізації зерен срібла, які розміщуються напроти місць, де міститься мічена речовина. За інтенсивністю мічення можна визначити відносний вміст радіоактивної речовини в різних ділянках клітини.

 

Культура тканин.

Метод полягає в тому, що окремі органи (або їх частини), тканини і клітини переносять у пробірки, які містять рідки чи тверді (із агаром) поживні середовища у комбінації з мінеральними солями, вітамінами, фітогормонами і сахарозою. Вирощування проводять у строго контрольованих умовах, за умови повної стерильності.

Метод культури іn vitro сприяє розвитку експериментальної цитоембріології. На поживних середовищах успішно вирощують насіннєві зачатки і зародки, виділені на різних стадіях розвитку. Широко проводяться роботи по культивуванню пиляків і пророщуванню пилкових зерен різних стадій розвитку та пилкових трубок. Цей метод сприяє поглибленому дослідженню запліднення і особливостям взаємодії зародка і ендосперму в ході розвитку насіння. Даний метод є найбільш ефективним при подоланні міжвидової несумісності, при одержанні гібридних форм цінних сільськогосподарських рослин. Метод культивування використовують для вивчення функціональних особливостей ембріональних структур.

 

Метод ферментативної мацерації насіннєвих зачатків. Мацеруючими речовинами є ферменти - пектиназа і цитаза, які діють специфічно, руйнують міжклітинну речовину і не впливають на внутрішню структуру клітини.

Насіннєві зачатки, попередньо зафіксовані і промиті проточною водою, переносять у пробірки із ферментом (цитазою), який у 2-3 рази перевищує обсяг тканин. По мірі руйнування міжклітинної речовини насіннєві зачатки розпадаються на окремі клітини.

Після закінчення мацерації суспензію центрифугують. Відмиті дистильованою водою клітини фарбують у тих же пробірках.

При виготовленні препаратів для мікроскопічного аналізу на предметне скло, в краплю гліцерину, наносять незначну кількість суспензії і накривають покривним скельцем. Підраховують від 40 до 100 зародкових мішків.

 

Етапи розвитку ембріології.

Цитоембріологія рослин відокремилась у самостійну наукову дисципліну у другій половині 19 століття. В середині 19 століття уже були з'ясовані основні риси будови і функцій генеративних органів квіткових рослин, встановлено проростання пилкових зерен і утворення пилкової трубки, що доростає до зародкового мішка, вивчені перші етапи формування зародка. Деталі будови і розвитку чоловічого і жіночого гаметофітів залишались ще недостатньо вивченими.

Ембріологи другої половини 19 і початку 20 століття спрямували дослідження в цьому напрямі (В. Гофмейстер, В. Вармінг, Е. Страсбургер, М. їрейб, Л. Гиньяр, І. Ганштейн та ін.).

Е. Страсбургер (1877) вперше дослідив розвиток зародкового мішка. Запропонована ним термінологія збереглася досі. Він описав двоклітинні пилкові зерна, але допустив помилку у визначенні вегетативної і генеративної клітин. Страсбургер перший описав процес запліднення у рослин на прикладі голонасінних, але припустився помилки, вважаючи, що два спермії у пилковій трубці розчинюються і дифузно, через оболонку пилкової трубки, входять до яйцеклітини. Потім знову відновлюються і один з них запліднює яйцеклітину.

Л. Гиньяр досліджував запліднення у покритонасінних рослин і описав злиття одного із сперміїв з яйцеклітиною.

Згодом роботами Е. Страсбургера (1875) і Л. Гиньяра (1886) було чітко встановлено, що у пилковій трубці знаходяться два спермії, котрі виникають при поділі генеративної клітини. Один із сперміїв зливається з ядром яйцеклітини. Доля іншого спермія до кінця 19 століття залишалась нез’ясованою.

С.Г. Навашин (1898) - російський вчений, який працював у Київському університеті, виявив присутність обох сперміїв у зародковому мішку. Вивчаючи запліднення у Lilium martagon С.Г. Навашин встановив, що другий спермій також приймає участь у заплідненні: він зливається з верхнім полярним ядром. Об'єднання одного спермія із ядром яйцеклітини, а другого - з полярним ядром або ядром центральної клітини, що виникає внаслідок злиття двох полярних ядер, одержало назву подвійного запліднення.

С.Г. Навашин створив у Києві школу ембріологів і цитологів, його учнями були: Н. Цингер, Г. Левитський, В. Фінн, Е. Модилевський, М. Навашин, М. Чернояров та ін.

Найбільш вагомий вклад у розвиток цитоембріології на Україні в цей період зробили К. Модилевський (1929) і В. Фінн (1941). Е. Модилевський детально охарактеризував різні типи зародкових мішків і дав їх класифікацію. Його роботи були присвячені вивченню мейозу, апоміксису, гаплоїдії, амфіплоїдії.

В. Фінн вивчав чоловічий гаметофіт. Він вперше переконливо, на великому фактичному матеріалі, доказав наявність клітин сперміїв (1928-1941) для покритонасінних рослин.

Особливо помітні зміни відбулися в цитоембріології починаючи з 60 років 20 століття, коли, поруч з морфолого-описовим методом, стали застосовувати й інші сучасні методи дослідження. Широке розповсюдження одержав експеримент. Все це дозволило, одночасно і паралельно, вивчати морфологію і функцію основних ембріональних процесів.

Великі й потужні школи цитоембріологів працюючі, зараз у Франції, Італії, США, Індії, Нідерландах, Росії. На Україні школу ембріологів очолює член-кор. НАНУ, докт. біол. наук, професор Е.Л. Кордюм.

 

Лекція 2.