Тема V. Гормональна регуляція в культурі клітин

І ТКАНИН.

Робота 1. ІНДУКЦІЯ ОРГАНОГЕНЕЗУ І СОМАТИЧНОГО

ЕМБРІОГЕНЕЗУ В КАЛУСНІЙ ТКАНИНІ ТЮТЮНУ

ПІД ДІЄЮ ФІТОГОРМОНІВ

Теоретичні відомості

Фітогормони - це біологічні регулятори росту і розвитку рослин, що здійснюють взаємодію клітин, тканин та органів, які стимулюють морфогенетичні, і інгібують фізіологічні процеси в рослинних організмах. Фітогормони впливають на ділення і ріст клітин розтягуванням, стан спокою, дозрівання, старіння, формування статі, стійкості до стресу, тропізми, транспірування; забезпечують функциональну цілісність рослинного організму, закономірну послідовність фаз індивідуального розвитку.

За хімічною природою гормони рослин чітко підрозділяються на дві групи: похідні мевалонової кислоти (гіберелліни, абсцизини, брасини, фузикокцин, цитокініни), похідні амінокислот (ауксини - з триптофану, етилен - з метіоніну і аланіну). Біосинтез фітогормонів відбувається в певних частинах рослин: в апексах пагонів утворюється ІОК- індоліл-3-оцтова кислота, лист служить донором ключового продукту синтезу гіберелінів - каурену, а також абсцизової кислоти, в апексах коріння синтезується кінетин, а в зоні розтягування кореню - гібереліни, джерелом зеатину є ендосперм проростаючого насіння.

По функціональній дії розрізняють 5 основних груп фітогормонів: ауксини, цитокініни, гіберелліни, абсцизини і етилен. Ауксини в культурі тканин викликають ріст клітин розтягуванням, у великих концентраціях - ділення клітин, у поєднанні з цитокінінами - органогенез. У біотехнології застосовують як природні ауксини (ІОК), так і синтетичні [ІМК (індоліл-3-масляна кислота), ІПК (індоліл-3-пропіонова кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота), НОК (нафтилоцтова кислота)].

Цитокініни у поєднанні з ауксинами індукують мітози, проліферацію клітин, бруньок і пагонів. До природних цитокінінів відносяться: зеатин, кінетин (6-фурфуриламінопурин), NN -дифенілсечовина (кокосове молоко); до синтетичних - 6-БАП (6-бензиламінопурин).

Гіберелліни стимулюють ріст клітин розтягуванням, а також синтез ауксинів і цитокінінів. Зараз відомі близько 60 видів гібереллінів. У культурі тканинин використовується гіберелінова кислота.

Абсцизини (АБК - абсцизова кислота) і етилен інгібірують ростові процеси, ділення клітин, у поєднанні з цитокінінами і хлорхолінхлоридом індукують органогенез (утворення мікробульб).

Гормональна система тісно пов'язана з генетичним апаратом клітини. Фітогормони не лише впливають на міру метилування ДНК і таким чином регулюють експресію генів, але і зв'язуються з білками - репресорами на опероні, що призводить до активації структурних генів і синтезу певних ферментів. Отже, змінюючи співвідношення гормонів в поживних середовищах, можна якоюсь мірою змінювати і генетичні програми клітин та тканин. Ці процеси відомі як дедиференціація, редиференціація і диференціація клітин і тканин.

 

Матеріали і устаткування. Пробірки з калусами тютюну, колби на 50 мл із стерильним поживним середовищем (МС без гормонів), колби з середовищами для стеблового органогенезу і соматичного ембріогенезу і індукції ризогенезу, флакони з 96 % спиртом, стерильні пінцети і препарувальні голки, спиртівка, ламинар-бокс.

 

Хід роботи.

1. Стерильним пінцетом перекласти калуси на стерильну поверхню столу ламінар-бокса, розділити на шматочки 5х5 мм. і помістити в колби з поживними середовищами, що містять різні набори фітогормонів.

2. Колби перенести в культуральну кімнату з температурою 25 + 2^оС, вологістю повітря 70 % і інтенсивністю освітлення 5кLх.

4. Результати експерименту замалювати через 2-4-6-8 тижнів.

 

Робота 2. ІНДУКЦІЯ ДІЛЕННЯ І РОСТУ КЛІТИН

РОЗТЯГУВАННЯМ ПІД ДІЄЮ АУКСИНУ І ГІБЕРЕЛІНУ

 

Теоретичні відомості

У рослині фітогормони знаходяться в тісній взаємодії один з одним: ІОК індукує синтез етилену і цитокінінів, ГК збільшує вміст ІОК, цитокініни посилюють синтез МОК, але знижують вміст вільною АБК, етилен гальмує транспорт ІОК і збільшує вміст АБК.

У культурі тканини фітогормони, додані в різних пропорціях, регулюють синтез ендогенних гормонів рослин, що проявляється в різноманітних морфогенетичних реакціях клітин і тканин.

У 1955 р. Скуг і Міллер запропонували гіпотезу гормональної регуляції в культурі клітин і тканин, яка зараз відома, як правило Скуга-Міллера: якщо концентрація ауксинів і цитокінінів в поживному середовищі відносно рівні або концентрація ауксинів трохи перевершує концентрацію цитокінінів, тоді утворюється калус; якщо концентрація ауксинів значно перевершує концентрацію цитокінінів, то формується коріння; якщо концентрація ауксинів значно менше концентрації цитокінінів, то утворюються бруньки, пагони.

Фітогормони здатні змінювати проникність клітинних мембран. Під дією ауксинів і гіберелінів посилюється викид протонів з клітини, що призводить до підкислення клітинної стінки і послаблення зв'язків між целюлозним волокном в результаті часткового кислотного гідролізу пектинових речовин. Тому клітинна стінка стає еластичнішою і під дією тургорного тиску вакуолі клітина набуває здатність до розтягування.

 

Матеріали і устаткування. Насіння пшениці і тритікале, колби з дистильованою водою, 6 % хлорамін, чашки Петрі з розчинами гормонів, стерильні пінцети, спиртівки, 96% спирт, ламінар-бокс.

 

Хід роботи.

1. Відібрати 30 шт здорового насіння пшениці або тритикале.

2. Насіння простерилізувати в розчині хлораміну протягом 5 хвилин.

3. Промити насіння автоклавованою водою 3 рази.

4. Стерильним пінцетом помістити насіння в чашки Петрі з дистильованою водою, розчином 2,4-Д (5-10 мг/л), розчином гіберелової кислоти (2-4 мг/л).

5. Закрити чашки Петрі і помістити в термостат при температурі 25 + 2^оС і вологості повітря 70 %

6. Результати досліду замалювати через 2-4 тижні.

 

Контрольні питання до теми V.

1. Що таке фітогормони і які процеси в рослинних клітинах і тканинах вони стимулюють?

2. Які групи фітогормонів стимулюють і інгібірують ріст та розвиток рослин?

3. Як здійснюється гормональна регуляція в культурі клітин і тканин?

4. Яка хімічна природа фітогормонів, і в яких органах рослини вони синтезуються?

5. Яким чином гормональна система впливає на генетичний апарат клітини?