Тема 4. Суспензійні культури.

РОБОТА 1. ОТРИМАННЯ І КУЛЬТИВУВАННЯ СУСПЕНЗІЇ.

 

Теоретичні відомості

Суспензійні культури - це поодинокі клітини, дрібні, середні і великі агрегати (групи клітин), що вирощуються в рідкому поживному середовищі при постійній аерації (доступі кисню) в асептичних умовах. Суспензії отримують з калусів. Для ініціації суспензійної культури потрібно 2-3 г свіжої рихлої маси калусних клітин на 60-100 мл рідкого поживного середовища. Первинну суспензію культивують в колбах з рідким поживним середовищем на кругових гойдалках із швидкістю 100-120 об./хв.

Модельна крива росту суспензії має S-подібну форму і включає: лаг-фазу, експоненціальну фазу, стаціонарну фазу і фазу деградації. Форма реальних ростових кривих відрізняється тривалістю фаз. Це залежить від генетики популяції, кількості інокулюма та складу поживного середовища. Швидкість наростання біомаси коливається від 15 до 70 діб.

Суспензії використовують для отримання важливих хімічних речовин: органічних кислот, ферментів, алкалоїдів, барвників, білків, амінокислот, які застосовуються у фармакології, парфумерії, харчовій і хімічній промисловості, сільському господарстві.

Суспензійні культури мають велике значення для генетики і особливо молекулярної біології: з суспензійних клітин отримують протопласти, що використовуються для соматичної гібридизації, генетичної інженерії, а також для вивчення метаболізму клітин.

 

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, пробірки з рихлими калусами тютюну (середовище МС+2,4-Д 2мг/л), колби з поживним середовищем для ініціацій суспензії, магнітні мішалки, стерильні інструменти, флакон з 96 % спиртом.

 

Хід роботи.

1. У асептичних умовах витягнути калус з пробірки і помістити в колбу з поживним середовищем, з розрахунку 2-3 г на 100мл середовища:

1. МС+2,4-Д,

2. МС+ІОК,

3.МС+ІОК+6-БАП,

4. МС без гормонів.

2. Колби з суспензією помістити на кругові гойдалки при 100-120 об/хв і залишити на 2 тижні.

3. Результати культивування суспензії на різних по складу середовищах замалювати і зробити висновки.

 

 

Робота 2. ПІДРАХУНОК ГУСТИНИ СУСПЕНЗІЇ.

Теоретичні відомості

За густиною суспензії можна не лише охарактеризувати стан клітинної популяції, але і визначити час субкультивування (відбору інокулянта і пересадки на свіже поживне середовище). В більшості випадків суспензію для субкультивування відбирають у кінці експоненціальної фази (через 14-16 днів після початку культивування). При побудові кривої росту показники знімають через день. Щільність суспензії за 2-3 тижні культивування зростає в 20 разів. Клітини суспензій зручніше усього підраховувати в спеціальних рахункових камерах Фукса-Розенталя (гемоцитомерах). Для підрахунку клітин суспензії іноді використовують тимчасові препарати, але це більш трудомісткий процес: значно збільшується число повторностей.

Об'єм вибірки повинен складати не менше 1000 клітин. Підрахунок клітин утруднюється, якщо в суспензії переважає фракція агрегатів. У таких випадках до 1 об'єму культури додають 2 об'єми 8 % оксиду хрому і нагрівають до 70⁰С протягом 2-15 хвилин. Після охолодження культуру струшують, щоб розпалися агрегати. Для руйнування агрегатів в суспензію додають пектиназу - 0,25 % об'єму.

Густину суспензії можна визначити і по співвідношенню об'єму біомаси до загального об'єму суспензії. Вимірюють середній об'єм клітини і отримують число клітин в 1 мл суспензії.

 

Матеріали і устаткування. Мікроскоп, центрифуга, колба з суспензією, стерильна піпетка, предметне скло, покривне скло, камера для підрахунку елементів крові, фільтрувальний папір.

 

Хід роботи.

1. Колбу з суспензією струсити і відібрати піпеткою декілька мл суспензії.

2. 1 мл суспензії змішати з 2 мл 8 % оксиду хрому і поставити на 15 хвилин в термостат при температурі 70⁰С.

3. Суміш пропустити 3 рази через шприц з товстою голкою.

4. Камеру Фукса-Розенталя заповнити суспензією.

5. Підрахувати клітини під мікроскопом.

6. Густину суспензії розрахувати по формулі:

 

 

де Х - число клітин в мл,

М - середнє число клітин в камері,

n - розведення.