Тема 1. Техніка культивування рослинного матеріалу на штучних поживних середовищах.

Затверджено

на засіданні кафедри ТБСФБ

Протокол № від

 

Львів 2010

Методичні вказівки з курсу “ Технологія біологічно активних речовин ” для студентів спеціальності 7(8) 110204 “Технологія фармацевтичних препаратів” /Упорядники: Стадницька Н.Є., Стасевич М.В., Миколів О.Б., Новіков В.П. - Національний університет „Львівська політехніка”.- 2010.- 32 с.

 

 

Укладачі: Стадницька Н.Є., к.х.н., доц.

Стасевич М.В., к.х.н., доц.

Миколів О.Б., ас.

Новіков В.П., д.х.н., проф..

 

 

Рецензенти: Лубенець В.І., д.х.н., проф.

 

 

Відповідальний за випуск: Новіков В.П., д.х.н., проф.

 

ЗМІСТ:

Вступ
Тема 1. Техніка культивування рослинного матеріалу на штучних поживних середовищах.
Робота 1. Організація лабораторії.
Робота 2. Приготування поживних середовищ для культивування клітин і тканин in vitro.
Робота 3. Способи стерилізації.
Робота 4. Способи стерилізації рослинних експлантів.
Робота 5. Техніка роботи в ламінарі при культивуванні стерильних проростків.
Тема 2. Мікроклональне розмноження рослин і отримання безвірусного посадкового матеріалу.
Робота 1. Відокремлення апікальних меристем і регенерація рослин.
Робота 2. Проліферація пагонів і мікроживлення стерильних проростків.
Робота 3. Індукція коренеутворення при мікроклональному розмноженні рослин.
Робота 4. Отримання мікробульб картоплі in vitro.
Робота 5. Імуноферментний аналіз. Тестування рослинного матеріалу на вміст вірусів.
Робота 6. Одержання безвірусного посадкового матеріалу методом термотерапії у поєднанні з культивуванням апікальних меристем.
Робота 7. Одержання безвірусного посадкового матеріалу методом хіміотерапії у поєднанні з методом апікальних меристем.
Тема 3. Дедиференціація і калусогенез в культурі рослинних клітин і тканин.
Робота 1. Отримання калусів з листя тютюну.
Робота 2. Отримання калусів з незрілих зародків і вузлів кущіння пшениці.
Робота 3. Отримання калусів з корінців квасолі.
Робота 4. Субкультивування калусів.
Тема 4. Суспензійні культури.
Робота 1. Отримання і культивування суспензії.
Робота 2. Розрахунок щільності суспензії.
Робота 3. Визначення міри агрегації і життєздатності суспензії.
Робота 4. Отримання клітинних клонів на агаризованих середовищах. Метод Плейтинга.
Тема 5. Гормональна регуляція в культурі клітин і тканин.
Робота 1. Індукція органогенезу і соматичного ембріогенезу в калусній тканині тютюну під дією фітогормонів.
Робота 2. Індукція ділення клітин і ріст клітин розтягуванням під дією ауксину і гіббереліну.
Тема 6. Культура гаплоїдних клітин.
Робота 1. Отримання калусів з пильників вишні і яблуні.
Робота 2. Отримання рослин - регенерантів з пилкових калусів вишні.
Термінологія.
Додаток.
Список літератури.

 

ТЕМА 1. ТЕХНІКА КУЛЬТИВУВАННЯ РОСЛИННОГО МАТЕРІАЛУ НА ШТУЧНИХ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩАХ.

Робота 1. ОРГАНІЗАЦІЯ ЛАБОРАТОРІЇ

Техніка безпеки при роботі в лабораторії

Загальні положення

1. Під час роботи в лабораторії слід дотримуватися чистоти, тиші та порядку, чітко виконувати правила безпеки. Стороннім особам забороняється відвідувати студентів, які працюють в лабораторії.

2. Забороняється пити і приймати їжу в лабораторії.

3. Після користування водою та джерелами електроенергії негайно закривати крани і вимикати електроприлади.

4. Не кидати в умивальник папір, вату та інші предмети.

5. При несправності електричної проводки, газо- та водопровідної мереж, лабораторного посуду, тяг, приладів та ін. слід негайно повідомити про це чергового лаборанта чи викладача.

6. Забороняється проводити в лабораторії будь-які роботи, не пов’язані з дорученим завданням.

7. Не розпочинати роботу без повного розуміння техніки її виконання.

Правила техніки безпеки

1. Роботу в лаборатрії потрібно виконувати в халатах з бавовняної тканини, котрі застібаються спереду.

2. Всі досліди з концентрованими кислотами, лугами, газоподібними речовинами, органічними розчинниками слід проводити у витяжній шафі.

3. При роботі з лугами і кислотами особливо бути уважними, вдягати захисні окуляри. При роботі з легкозаймистими речовинами забороняється використовувати відкрите полум’я.

4. Забороняється нагрівати горючі рідини на відкоитому полум’ї, на сітці, поблизу відкритого полум’я або у відкритих ємностях.

5. Забороняється випарювати на столах розчини, що виділяють токсичні гази.

6. Забороняється набирати кислоти та інші агресивні рідини в піпетку ротом, у цьому випадку необхідно користуватися гумовою грушею, градуйованими шприцами чи бюретками.

7. Забороняється виливати в раковину концентровані кислоти, луги, органічні розчинники, ртуть та її сполуки, сильнопахучі речовини. Їх збирають в окремий посуд з написом.

8. При нагріванні пробірок з розчинами їх слід тримати спеціальними щипцями відкритим кінцем від себе і людей, що стоять поруч. Не можна користуватися пробірками з тріщинами.

9. При нагріванні рідин з осадом треба бути обережним у зв’язку з можливістю викиду з ємності гарячої реакційної маси.

10. Забороняється проводити досліди у брудному посуді.

11. При роботі з хімічними реактивами забороняється визначати їх на смак.

12. Приливаючи агресивні рідини, необхідно користуватися захисними окулярами, рукавицями і фартухами.

13. Забороняється залишати без нагляду включені прилади і газ.

14. Працювати з центрифугою та іншим лабораторним обладнанням дозволяється тільки після детального ознайомлення з його технічним описом та інструкцією.

15. Випарювання, кип’ятіння і прокалювання речовин необхідно проводити у витяжній шафі.

 

Теоретичні відомості

Компоненти середовища для вирощування рослинних клітин і тканин можна розділити на 6 основних груп, які зазвичай відображають порядок приготування концентрованих маточних розчинів: макроелементи, мікроелементи, джерела заліза, вітаміни, джерела вуглецю, фітогормони.

Основою для усіх поживних середовищ для культивування рослинних експлантів є суміш мінеральних солей. Це сполуки азоту у вигляді нітратів, нітриту, солей амонію; фосфору - у вигляді фосфатів; сірки - у вигляді сульфатів; а також розчинних солей К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Мg⁺⁺. Залізо використовується у вигляді хелатів [FeО₄ або Fe₂O₄ + ЕДТА (етилендіамінтетраоцтова кислота) або її натрієва сіль Na ЕДТА (трилон Б)] - найбільш доступній формі для засвоєння рослинними тканинами.

Азот, фосфор, сірка входять до складу органічних сполук: білків, жирів, нуклеїнових кислот. Залізо, цинк, марганець, молібден, кобальт в поєднанні з порфіринами утворюють макромолекули пігментів фотосинтезу (хлорофілу), окислювально-відновлювальних ферментів (каталази, пероксидази, поліфенолоксидази). Отже, усі ці сполуки виконують в клітинах і тканинах структурну функцію. В той же час іони К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Cl^-, Н⁺ необхідні для регуляції pH середовища і підтримування фізіологічних градієнтів клітин (тургору, осмотичного тиску, полярності).

Як джерело вуглецю для біологічних макромолекул, а також при культивуванні гетеротрофних тканин (каллусів і суспензій) в поживні середовища додають вуглеводи в концентрації 20-60 г/л. Звичайно це дисахариди (сахароза), моносахариди (гексози: глюкоза і фруктоза, пентози: ксилоза і інші). Полісахариди в поживних середовищах практично не використовуються. Тільки деякі типи тканин (пухлинні), що містять гідролітичні ферменти, вирощують на середовищах з крохмалем, рафінозою, целлобіозою.

Для стимуляції біохімічних реакцій в клітині використовують біологічні каталізатори - вітаміни групи В (В₁, В₆, В₁₂), С (аскорбінову кислоту), РР (нікотинову кислоту), мезоінозит.

Тіамін (В₁) входить до складу піруватдекарбоксилази, бере участь в перетвореннях вуглеводів. Тіамінпірофосфат входить до складу ферментів окислювального декарбоксилювання кетокислот (піровиноградною і кетоглутаровою), є коферментом транскетолази.

Піридоксин (В₆) у вигляді фосфорнокислого ефіру входить до складу ферментів декарбоксилювання і переамінування амінокислот.

Нікотинова кислота (РР) у вигляді аміду входить до складу дегідрогенази НАД і НАДФ, що каталізують донорно-акцепторний ланцюг Н⁺ (видалення Н⁺ від молекул органічних речовин).

Для керування процесами формоутворення в культурі тканин необхідні біологічні регулятори росту і розвитку - фітогормони. Ці речовини впливають на диференціацію і дедиференціацію клітин і тканин, ініціюють гістогенез, індукують ділення і розтягування клітин, беруть участь в процесах старіння і дозрівання, або стимулюють чи інгібують ріст та розвиток клітинних культур, обумовлюють формування статі. У біотехнологічних дослідженнях частіше використовують гормони, які стимулюють ріст і розвиток: ауксини, цитокініни, гібереліни.

Ауксини: ІОК - β-індоліл-3-оцтова кислота, ІМК - індоліл-3-масляна кислота, НОК - α -нафтилоцтова кислота, 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота.

Цитокініни: кінетин - 6-фурфуриламінопурин, зеатин, NN -дифеніл-сечовина, 6-БАП - 6-бензиламінопурин.

Гібереліни: гіберелова кислота.

Як біологічні добавки для індукції первинного калусу можна використовувати рослинні екстракти (10-15 % від загального об'єму середовища): кокосове молоко (рідкий ендосперм кокосового горіха), витяжки з незрілих зерен кукурудзи (краще в період молочної стиглості), які містять цитокініни, - кінетин і зеатин (6-ти заміщені амінопурини) і NN –дифенілсечовину.

У культурі in vitro застосовують рідкі і агаризовані (тверді) середовища. Рідкі середовища використовуються для культивування суспензій, калусів, ізольованих органів і тканин, рослин-регенерантів. При цьому для підтримки експлантів в пробірки з середовищем поміщають спеціальні містки-підтримки з фільтрувального паперу або синтетичних пористих матеріалів.

Агаризовані середовища готують на основі агар-агару - полісахариду, який входить до складу морських водоростей і який утворює з водою гель при pH 5,6-6,0. Іноді як загущувач і замінник агар-агару використовують поліакриламідні гелі (біогелі) P10 і P200.

Для штучних поживних середовищ розчини макро- та мікросолей готують заздалегідь і використовують багаторазово. Це маточні (концентровані) розчини. Їх зберігають в спеціальних умовах: макро- і мікросолі в холодильнику в посудинах з притертими корками при 0…+4^оС; вітаміни, фітогормони, ферменти, рослинні екстракти - при -20^оС в невеликих, по 5-10 мл ємностях з корками (пеніцилінові флакони).

Маточні розчини макросолей зазвичай перевищують робочі в концентрації в 10-40 разів, мікросолей - в 100-1000 разів, вітамінів - в 1000 разів.

Розчини фітогормонів бажано готувати безпосередньо перед роботою з середовищами.

Для приготування маточного розчину макро- і мікросолей, кожну сіль розчиняють в окремій скляночці при нагріванні, потім зливають і доводять до потрібного об'єму. В охолоджену суміш мікросолей останнім додають розчин солей молібдену, а в макросолі - розчин солей магнію (для запобігання випадання осаду).

Маточні розчини хлористого кальцію і хелату заліза (сірчанокисле залізо + ЕДТА, або Na ЕДТА - трилон Б) готують і зберігають окремо від інших солей.

Концентровані розчини вітамінів готують таким чином: 10-кратні наважки розчиняють в 10 мл дистильованої води кожну окремо.

Фітогормони - це речовини, які погано розчиняються у воді. Тому попередньо 100 мг речовини розчиняють в невеликих кількостях (0,5-2,0 мл) спирту (ауксини, гібереліни), 0,5-1н HCl або КОН (цитокініни), потім підігрівають до повного розчинення (окрім абсцизової кислоти і кінетину) і доводять до 100 мл об'єму (1 мл містить 1 мг речовини).

 

Матеріали і устаткування. Хімічні склянки, колби, мірні циліндри від 5 мл до 2 л, пробірки, піпетки від 0,01 мл до 10 мл або дозатори, ваги аналітичні до 500 г, ваги торсійні до 100 мг, пінцети, ножиці, шпателі, електроплитки, магнітні мішалки, хімічні реактиви або готові маточні розчини макро- і мікросолей, вітамінів, фітогормонів.

 

Хід роботи.

1. У хімічну склянку місткістю 2 л помістити 20 г сахарози, долити дистильованої води до 400 мл і розчинити.

2. Додати до розчину сахарози 50 мл маточного розчину макросолей, 1 мл мікросолей, 5 мл хелату заліза, 5 мл хлористого кальцію.

3. Приготувати агар: наважку 7 г помістити в склянку і залити водою до 200 мл, розчинити, нагріваючи на плитці або газовому пальнику, при постійному перемішуванні. Готовий агар долити до розчину солей.

4. Поживне середовище довести до потрібного об'єму (1 л) дистильованою водою. Виміряти pH середовища: якщо pH перевищує 5,5-6,0 додати декілька крапель 0,1 н HCl, якщо нижче за це значення - 0,1 н КОН.

5. Готове поживне середовище розлити в пробірки на 1/3 об'єму, закрити пробірки ватними корками, помістити пробірки в металеві штативи.

6. Штативи з пробірками загорнути в целофановий папір (щоб в автоклаві не відкрилися корки).

7. Помістити штативи з пробірками в автоклав і проавтоклавувати.

 

Робота 3. МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ

Теоретичні відомості

Усі роботи з культурою клітин і тканин in vitro проводять в стерильних (асептичних) умовах в стерильному боксі або ламінар-боксі, стерильними інструментами, в стерильному посуді, на стерильних поживних середовищах. У разі порушення стерильності на середовищах добре розвиваються мікроорганізми (гриби, бактерії), створюються умови, при яких порушується склад і пригнічують ріст рослинних експлантів.

Найчастіше для стерилізації приміщень (боксів для пересадки тканин, культуральних кімнат) використовують ультрафіолетове опромінення протягом 0,5-2 годин (залежно від площі приміщення). Роботи в опроміненому приміщенні починають через 15-20 хвилин після відключення бактерицидних ламп, оскільки під дією ультрафіолетового випромінювання двоатомний кисень повітря стає трьохатомним озоном - газом, токсичним для людини. Для досягнення максимальної стерильності перед обробкою УФ усі поверхні ретельно миються миючими засобами, водою і розчинами хлоровмісних речовин, поверхні ламінар-боксу обробляють 96 % спиртом.

Посуд, халати, вату, папір, дистильовану воду, поживні середовища стерилізують в автоклавах під тиском пари 1-2 атм і температурою 120^оС протягом 20-60 хв, залежно від об'єму матеріалу, що стерилізується.

Колби, штативи з середовищем, вату, папір, халати перед автоклавуванням завертають в целофановий папір, або поміщають в бюкси.

Металеві інструменти автоклавувати не можна, оскільки під дією пари утворюється іржа. Тому їх стерилізують сухим жаром в термостатах з температурою 170-250^оС протягом 1-2 годин.

 

 

Матеріали і устаткування. Чашки Петрі, колби з дистильованою водою, штативи з пробірками, заповненими поживним середовищем, препарувальні голки, пінцети, скальпелі, вата, марля, папір: фільтрувальний і целофановий.

 

 

Хід роботи.

1. Металеві інструменти загорнути в щільний папір і помістити в сушильну шафу для стерилізації сухим жаром при t=170-200^oС протягом 2 годин.

2. Чашки Петрі, штативи з пробірками, заповненими поживним середовищем, вату, марлю, фільтрувальний папір, колби з дистильованою водою (закриті фольгою) загорнути в целофановий папір і помістити в автоклав.

3. Автоклав привести в робочий стан: закрити щільно кришку, воду залити до мітки. Включити автоклав, тиск пари довести до мітки 1,2 атм. (у паровій камері) заповнити парою камеру стерилізації, витіснити конденсат протягом 10 хв., при цьому тиск пари в камері стерилізації має бути на рівні 0,1-0,2 атм. Довести тиск в камері стерилізації до 1 атм., включити автоматичний режим.

4. Автоклавувати 20 хв. при тиску в камері стерилізації 1-1,2 атм.

5. Відключити автоклав, витіснити пару з обох камер, довести тиск до 0 атм.

6. Проавтоклавувальні матеріали перенести в кімнату для пересадки тканин і помістити в шафи або на стелажі.

 

Робота 4. СПОСОБИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ РОСЛИННИХ ЕКСПЛАНТІВ

 

Теоретичні відомості

З метою отримання експлантів для калусної і пухлинної культур, мікроклонального розмноження, вивчення гормональної регуляції використовують стерильні проростки. Насіння для пророщування висівають або на воду, або на поживне середовище.

Рослинні об'єкти перед стерилізацією ретельно відмивають проточною водою, іноді з миючими засобами, очищають від зайвих тканин. З коренеплодів і коріння знімають шкірку, з пагонів - кору, з бруньок – покривні луски.

Рослинні експланти стерилізують розчинами речовин, що містять активний хлор (хлораміном, гіпохлоритом Са і Nа, сулемою), бром (бромистою водою), перекисом водню, спиртом, нітратом срібла, діацидом, антибіотиками. Етиловий спирт часто застосовують для попередньої стерилізації, протираючи ним поверхню матеріалу або занурюючи матеріал на декілька секунд в абсолютний спирт. Іноді такої стерилізації вистачає, її використовують при роботі з плодами, насінням, пагонами, зав'язями.

Гіпохлорит кальцію (хлорне вапно) використовується у вигляді 5-7 % розчину для обробки бруньок, зав'язей, квіток, насіння, пагонів протягом 5-8 хвилин. Гіпохлорит натрію використовується у вигляді 0,5-5 % розчину для обробки будь-яких експлантів протягом 1-20 хвилин. Ця речовина є клітинною отрутою, тому час стерилізації і концентрацію підбирають експериментально. Наприклад: для ізольованих зародків використовують 2-3 % розчин протягом 10-15 хвилин, а для сухого насіння 3-5 % розчин протягом 1 години. Залишки гіпохлориту натрію спочатку видаляють 0,01 н HCl, а потім 8 разів промивають автоклавувальною дистильованою водою.

Хлорамін застосовують в концентрації 1-6 %. Пильники і молоді зародки обробляють протягом 1-3 хвилин, сухе насіння - 30-60 хвилин, потім промивають стерильною дистильованою водою 2-3 рази.

Сулема - токсична речовина і вимагає особливої ретельності, як при зберіганні, так і при виборі концентрації для окремих об'єктів. Для стерилізації зародків використовують 0,1 % розчин протягом 1-3 хвилин, для корене- і бульбоплодів - до 10-20 хвилин.

Розчини, що містять активний хлор використовуються 1 раз і готують їх безпосередньо перед роботою.

Діацид використовується в 0,2 % розчині для стерилізації коренеплодів, насіння, шматочків тканин, верхівкових меристем, ізольованих зародків, пильників. Діацид готують, розчиняючи окремо 330 міліграм етанолмеркурхлориду і 660 міліграм цетилпіридинію хлориду в гарячій воді (330 мл), потім їх змішують і доводять об'єм рідини до 1 л, додають декілька крапель детергента твін- 80; зберігають в щільно закритій колбі в темряві.

Антибіотики застосовують для стерилізації рослинного матеріалу, інфікованого бактеріями (тканини корончатогалових пухлин). Найчастіше застосовують стрептоміцин і тетраміцин 10-80 мг/л, ампіцилін 200-400 мг/л, левоміцитин, каноміцин і інші.

 

Матеріали і устаткування. Стерильні чашки Петрі, колби з автоклавованою дистильованою водою, флакони із стерилізуючими розчинами, зернівки пшениці і тритікале, ламінар-бокс, флакон з 96 % спиртом, вата, спиртівка, пінцети, фільтрувальний папір.

 

Хід роботи.

1. Відібрати 30 здорових зернівок пшениці або тритікале.

2. У ламінар-бокс помістити насіння в чашки Петрі із стерилізуючими розчинами по 5 насінин в кожну (6 % хлорамін, 6 % гіпохлорит кальцію, 96 % спирт, сулема 0,1 %, ампіцилін 400 мг/л, вода). Час стерилізації підібрати експериментально.

3. Відмити насіння від стерилізуючих розчинів дистильованою автокла-вованою водою.

4. Помістити насіння для пророщування в стерильні чашки Петрі на стерильний фільтрувальний папір в невелику кількість стерильної дистильованої води. Чашки Петрі закрити і перенести в термостат для пророщування.

5. Результати досліду замалювати через тиждень. Зробити висновки про ефективність стерилізуючих розчинів.

 

 

Робота 5. ТЕХНІКА РОБОТИ В ЛАМІНАРІ ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ СТЕРИЛЬНИХ ПРОРОСТКІВ.

 

Теоретичні відомості

Для культивування стерильних проростків необхідно використовувати ламінар-бокси, що забезпечують посадку експлантів на поживне середовище без зараження мікроорганізмами.

Усі поверхні ламінару обробляються 96 % спиртом, простерилізовані інструменти, матеріали, рослинний матеріал поміщають на стіл ламінару і вмикають УФ-випромінювання. Через 20 хвилин вимикають УФ і включають біофільтри. Для роботи в ламінар-боксі надівають стерильний халат і шапочку, руки обробляю 96 % спиртом. Пінцети, скальпелі і препарувальні голки поміщають в склянку з 96 % спиртом. Перед кожною маніпуляцією інструменти обпалюють на полум'ї спиртівки.

 

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, пробірки з поживними середовищами, стерильні препарувальні голки, пінцети, скальпелі, флакон з 96 % спиртом, спиртівка, вата, 6 % розчин хлораміну, колби з автоклавованою дистильованою водою, чашки Петрі, зернівки пшениці.

 

Хід роботи.

1. Відібрати 10 здорових зернівок пшениці, помістити в 6 % розчин хлораміну на 5 хвилин, промити стерильною дистильованою водою.

2. Зернівку помістити на стіл ламінару борозенкою вниз.

3. Однією препарувальною голкою притримувати зернівку, іншою - надрізати оболонку навколо зародка.

4. Бічною частиною голки натиснути на зародок (на межі з ендоспермом) і вичленувати його із зернівки.

5. Зародок помістити в чашку Петрі із стерильною дистильованою водою.

6. Узяти зі штативу пробірку з поживним середовищем, обпалити шийку над спиртівкою, зняти пробку. Пробірку тримати відкритою частиною від себе.

7. Препарувальною голкою перенести зародок на поверхню поживного середовища щитком вниз (не заглиблювати).

8. Пробірку і шийку пробірки обпалити на полум'ї спиртівки, пробірку закрити.

9. Пробірки із зародками поставити в штатив і перенести на стелаж в культуральну кімнату.

10. Проростки пшениці замалювати через 1-2 тижні. Оцінити якість посадки.

 

Контрольні питання до теми 1.

1. Як влаштована біотехнологічна лабораторія?

2. Як простерилізувати поживні середовища, посуд, дистильовану воду, інструменти, приміщення лабораторії?

3. Які стерилізуючі розчини використовуються для рослинних експлантів?

4. Які речовини входять до складу поживних середовищ, і яку функцію вони виконують в культурі клітин і тканин in vitro?

5. Як отримують стерильні проростки і для чого їх використовують?

 

 

Тема 2. МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН І

РЕГЕНЕРАЦІЯ РОСЛИН

Теоретичні відомості

У культурі тканин можна розмножувати рослини і отримувати оздоровлений (безвірусний) посадковий матеріал. Для оздоровлення рослин використовують культуру апексів або культуру апікальних меристем, оскільки в стебловий апекс віруси проникають повільніше, ніж в інші частини рослин. При культивуванні апексів розмноження вірусів пригнічується реакцією рослинного організму на травму, викликану відсіканням верхівки. Зазвичай на поживні середовища висаджують невелику частину меристеми до 0,5 мм.

В цілому закономірність така: чим менше величина меристеми, тим більше вірогідність отримання безвірусних рослин.

Біотехнологія дозволяє отримувати безвірусний посадковий матеріал практично усіх сільськогосподарських культур. Найбільш повно розроблена технологія отримання безвірусного матеріалу картоплі. Система первинного насінництва і оздоровлення посадкового матеріалу картоплі включає наступні етапи: підготовка бульб для вичленення апікальних меристем, вичленення апікальних меристем, регенерація рослин з меристем, адаптація рослин-регенерантів в захищеному грунті, отримання первинної продукції безвірусного матеріалу у відкритому грунті, вирощування безвірусного посадкового матеріалу в первинних ланках насінництва, збереження колекції сортів.

У культурі тканин використовуються апекси верхівкових і бічних бруньок. Щоб виключити вплив метаболитів бульби на проростки і підвищити регенерацційну здатність початкового матеріалу з середньої частини бульби вирізають очка з частиною паренхіми (1,5 г 1,5 см). Очка пророщують на піску, заздалегідь обробленому сухим жаром. Етіольовані проростки вирощують в темряві при температурі 25 + 2^оС, вологості повітря 70-80 %. Пісок двічі в день зволожують, через 7-10 днів проводять підгодівлю розчином Кнопа.

Апікальні меристеми проростків ізолюють на 12-13 пластохроні (пластохрон - проміжок часу між ініціаціями двох листових горбків. В середньому від посадки меристеми на середовище до формування проростків з 5-6 листочками проходить 30-45 днів, в деяких випадках від 2 до 8 місяців. Середовища по мірі виснаження оновлюють, і проростки періодично пересаджують на нові середовища в стерильних умовах).

 

Ізольовані меристеми культивують в асептичних умовах на поживних середовищах з багатим вмістом макро- і мікросолей, з підвищеною концентрацією цитокінінів (6-БАП 2 мг/л). У культуральній кімнаті з кондиціонованим повітрям підтримують температуру 25 + 2^оС, вологість повітря 70 %, освітленість 5 кLx і фотоперіод 16 годин.

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, бінокулярний мікроскоп МБС- 9 або МБС- 10, флакони із стерилізуючими розчинами, (0,2 % діацид або 70 % спирт), чашки Петрі, стерильна дистильована вода, стерильні інструменти: пінцети, препарувальні голки, скальпелі, спиртівка, пробірки з середовищем.

 

Хід роботи.

1. Поверхня ламінару, штативи, пробірки, мікроскоп обробити ультрафіолетом і 96 % спиртом. Руки протерти спиртом. Препарувальні голки, пінцети, скальпелі помістити в 96 % спирт і перед кожною маніпуляцією обпалювати на полум'ї спиртівки.

2. Проростки (2 см) відокремити від бульб і помістити в чашки Петрі із стерилизуючими розчинами: в діацид на 3-5 хвилин, в спирт на 1-2 хвилини.

3. Проростки промити 3 рази стерильною дистильованою водою і перенести в стерильні чашки Петрі.

4. Тонкою препарувальною голкою у проростків видалити усе листя, послідовно оголяючи верхівкові і бічні меристеми з примордіями.

5. Меристему з 1-2 примордіями відокремити від проростків, при цьому розмір експланту має бути не більше 100-250 мкм.

6. Експланти перенести в пробірку на поверхню поживного середовища.

7. Пробірки закрити пробками, помістити в штатив і перенести в культуральную кімнату.

8. Результати замалювати через 2-4 тижні, зробити висновки.

 

 

Робота 2. ПРОЛІФЕРАЦІЯ ПАГОНІВ І МІКРОЖИВЛЕННЯ

СТЕРИЛЬНИХ ПРОРОСТКІВ.

Теоретичні відомості

Мікроклональне розмноження пробірних рослин здійснюють за допомогою живлення. Таке розмноження засноване на пригніченні апікального домінування і активації пазушних меристем при видаленні верхівки пагони. З пазушних бруньок на поживних середовищах утворюються пагони. Рослини, що сформували 5-6 листочків, в стерильних умовах виймають з пробірок і розрізають на частини (відрізок стебла з листом і пазушною брунькою). Живці висаджують на глибину меживузля в поживні середовища або без гормонів, або з додаванням ауксинів.

Живці культивують в тих же умовах, що і меристеми: при температурі 24-25^оС вдень і 19-20^оС вночі, освітленості 5-6 кLx і тривалість фотоперіоду 16 годин.

Ріст стебла і коріння починається на 3-4 день після посадки на поживне середовище, а повністю рослини формуються через 12-15 днів.

Кожне наступне живцювання проводять через 14-20 днів. З однієї рослини можна отримати 5-8 живців, а через 2-3 місяці - 3-5 тис. живців.

Нижню частину рослини використовують для ІФА. Рослини, заражені вірусами, бракують, а здорові дають початок мериклонам (меристематичним клонам).

Якщо бруньки або живці висадити на поживні середовища з високим вмістом цитокінінів, то утворюється конгломерат бруньок і пагонів. Отримані пагони легко відділяються один від одного, їх можна або укоренити, або використовувати для подальшого мікроживцювання.

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, пробірки з проростками, пробірки з поживним середовищем, скальпелі, препарувальні голки, спиртівка, флакон з 96 % спиртом.

 

Хід роботи.

1. Підготувати ламінар-бокс і інструменти до роботи.

2. У ламінарі витягнути стерильні проростки з пробірок.

3. Пагони розділити на мікроживців (меживузля з брунькою) і посадити в поживне середовище на глибину меживузля.

4. Пробірку закрити пробкою, помістити в штатив і перенести в культуральну кімнату.

5. Результати замалювати через 2-4 тижні. Зробити висновки про міру проліферації бруньок різних сільськогосподарських культур.

 

Робота 3. ІНДУКЦІЯ КОРЕНЕУТВОРЕННЯ ПРИ

Теоретичні відомості

Для вкорінення рослин, що утворилися при мікрочеренкуванні, їх необхідно пересадити на нове поживне середовище. Живці і пагони легко вкорінюються на середовищах із низьким складом мінеральних солей (середовище Уайта, Мурасіге-Скуга, розбавлене удвічі), або на середовищах з додаванням ауксинів: ІОК, НОК, ІМК.

Проростки, що сформувалися в пробірках з середовищами, можна розглядати як невеликі вкорінені рослини, які необхідно адаптувати до звичайних умов вирощування. Такі рослини краще пересаджувати в грунт, коли повністю сформуються 5-6 листків і досить розростеться коріння. Проте, різні види культурних рослин по-різному прилаштовуються до зміни умов середовища. Кожна рослина вимагає спеціально підібраних умов культивування в грунті, які встановлюють експериментально.

 

Матеріали і устаткування. Пробірки з проростками, пробірки з поживними середовищами для індукції коренеутворення: без гормонів і з додаванням ІОК, стерильні інструменти, ламінар-бокс, спиртівки, флакон з 96% спиртом, вата, стерильні чашки Петрі.

 

Хід роботи.

1. У стерильних умовах проростки витягнути з пробірок і стерильним пінцетом перенести в пробірки з поживними середовищами для вкорінення.

2. Пробірки з пересадженими рослинами поставити в штативи і перенести в культуральну кімнату з освітленням 5 кLx, температурою 25 + 2^оС і вологістю повітря 70 %.

3. Результати вкорінення оцінити через 1-4 тижні, зробити малюнки.

4. Укорінені рослини перенести в ящики або вегетаційні посудини з торфом і піском (3:1).

 

 

Робота 4. ОТРИМАННЯ МІКРОБУЛЬБ КАРТОПЛІ IN VITRO

 

Теоретичні відомості

У практиці біотехнології на штучних поживних середовищах з певним набором біологічних регуляторів можна викликати проліферацію бруньок і пагонів, укоренити їх, а також індукувати утворення мікробульб. Для цього зазвичай використовують середовища з високим вмістом мінеральних солей (Мурасіге-Скуга), вуглеводів (сахарози до 8 % від об’єму середовища), цитокінінів, абсцизової кислоти, хлорхолінхлориду.

Протягом перших 10- 12 діб після живцювання рослини вирощують на звичайному фотоперіоді (16-17 год) з інтенсивністю освітлення 3-5 кLx, при температурі 25^оС вдень і 19-20^оС вночі. Наступне культивування проводять на 12 годинному фотоперіоді при тій же мірі освітленості і температурі. В деяких випадках, після вирощування в умовах довгого дня пробірки переносять в холодильник з температурою 10^оС. Утворення мікро-бульб відбувається через 1-1,5 місяця.

Мікробульби зберігають в холодильнику при температурі +2…+5^оС і вологості повітря до 95 %. Їх закладають в стерильні пробірки без середовища по 10 штук в кожну і закривають пробками (термін зберігання до 6 місяців). Таким чином, створюються умови, відповідні періоду спокою картоплі, що сприяє кращій схожості і життєздатності рослин.

Увесь період від мікроживцювання до отримання мікробульб складає 60-65 днів.

 

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, пробірки з поживним середовищем для отримання мікробульб, пробірки із стерильними проростками, що мають 5-6 сформованих листків, флакони з 96 % спиртом для стерилізації інструментів, скальпелі, пінцети, препарувальні голки, спиртівка, вата, стерильні чашки Петрі.

 

Хід роботи.

1. У стерильних умовах, стерильними інструментами витягнути проростки з добре сформованим корінням з пробірок і перенести на поживні середовища для індукції бульбоутворення.

2. Пробірки з пересадженими в них рослинами закрити і перенести в культуральну кімнату.

3. Провести спостереження процесу бульбоутворення через 4-6-8 тижнів культивування.

4. Результати замалювати, зробити висновки на підставі теорії гормональної регуляції.

5. Закласти мікробульби на зберігання.

 

Робота 5. ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ. ТЕСТУВАННЯ

Теоретичні відомості

Принцип методу ІФА полягає в наступному: до одного з компонентів антиген-антитіло приєднують фермент, інший компонент сорбують на твердій фазі. Потім проводять реакцію нейтралізації, додають субстрат і визначають активність комплексу. Активність ферменту, тобто кількість комплексів, що утворилися, антиген-антитіло пропорційне змісту вірусів.

Для аналізу використовують полістеролові плата, в лунки яких додають сироватку і антитіла, отримані на основі тестованих вірусів з крові ссавців.

Антитіла адсорбуються на поверхні осередків плата протягом 6 годин. Залишки сироватки видаляють спеціальним буфером. Потім в лунки вносять досліджувальні витяжки рослин (сік листя, бульб). За наявності вірусного зараження утворюється комплекс вірус-антитіло. Обов'язково готують контрольні плата (без зараження). Після промивання буфером в осередки додають антитіла в комплексі з ферментами: фосфотазою і пероксидазою. У присутності вірусу на поверхні плата утворюється комплекс антиген-антитіло-фермент. Якщо матеріал стерильний, комплекси не утворюються, а залишки ферменту відмиваються буфером. Після усіх описаних вище маніпуляцій в лунки плата додають субстрат, на якому працює фермент (для фосфотази потрібні еритроцити крові, які руйнуються в її присутності).

В результаті реакції між ферментом і субстратом забарвлення розчинів в лунках плата змінюються залежно від міри зараження вірусом: немає забарвлення - "-" - вірус відсутній, світло-коричневе забарвлення - "+" - середнє зараження вірусом, яскраво-коричневе забарвлення -"++" - висока ступінь зараження вірусом.

Для успішного тестування вірусів необхідно створити стандартні умови, використовувати високоякісні антитіла, ферменти, плата.

Матеріали і устаткування. Полістеролові плата, рослинні екстракти, гомогенізатор, сироватки, розчини ферментів, кров ссавців, буферний розчин, центрифуга, рослинний матеріал.

 

Хід роботи.

1. Рослинний матеріал гомогенізують і центрифугують.

2. Заповнити сироваткою полістеролові плата і залишити для інкубації на 6 годин.

3. Промити плата буфером.