Робота 2. Приготування поживних середовищ для

КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН І ТКАНИН IN VITRO

 

Теоретичні відомості

Компоненти середовища для вирощування рослинних клітин і тканин можна розділити на 6 основних груп, які зазвичай відображають порядок приготування концентрованих маточних розчинів: макроелементи, мікроелементи, джерела заліза, вітаміни, джерела вуглецю, фітогормони.

Основою для усіх поживних середовищ для культивування рослинних експлантів є суміш мінеральних солей. Це сполуки азоту у вигляді нітратів, нітриту, солей амонію; фосфору - у вигляді фосфатів; сірки - у вигляді сульфатів; а також розчинних солей К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Мg⁺⁺. Залізо використовується у вигляді хелатів [FeО₄ або Fe₂O₄ + ЕДТА (етилендіамінтетраоцтова кислота) або її натрієва сіль Na ЕДТА (трилон Б)] - найбільш доступній формі для засвоєння рослинними тканинами.

Азот, фосфор, сірка входять до складу органічних сполук: білків, жирів, нуклеїнових кислот. Залізо, цинк, марганець, молібден, кобальт в поєднанні з порфіринами утворюють макромолекули пігментів фотосинтезу (хлорофілу), окислювально-відновлювальних ферментів (каталази, пероксидази, поліфенолоксидази). Отже, усі ці сполуки виконують в клітинах і тканинах структурну функцію. В той же час іони К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Cl^-, Н⁺ необхідні для регуляції pH середовища і підтримування фізіологічних градієнтів клітин (тургору, осмотичного тиску, полярності).

Як джерело вуглецю для біологічних макромолекул, а також при культивуванні гетеротрофних тканин (каллусів і суспензій) в поживні середовища додають вуглеводи в концентрації 20-60 г/л. Звичайно це дисахариди (сахароза), моносахариди (гексози: глюкоза і фруктоза, пентози: ксилоза і інші). Полісахариди в поживних середовищах практично не використовуються. Тільки деякі типи тканин (пухлинні), що містять гідролітичні ферменти, вирощують на середовищах з крохмалем, рафінозою, целлобіозою.

Для стимуляції біохімічних реакцій в клітині використовують біологічні каталізатори - вітаміни групи В (В₁, В₆, В₁₂), С (аскорбінову кислоту), РР (нікотинову кислоту), мезоінозит.

Тіамін (В₁) входить до складу піруватдекарбоксилази, бере участь в перетвореннях вуглеводів. Тіамінпірофосфат входить до складу ферментів окислювального декарбоксилювання кетокислот (піровиноградною і кетоглутаровою), є коферментом транскетолази.

Піридоксин (В₆) у вигляді фосфорнокислого ефіру входить до складу ферментів декарбоксилювання і переамінування амінокислот.

Нікотинова кислота (РР) у вигляді аміду входить до складу дегідрогенази НАД і НАДФ, що каталізують донорно-акцепторний ланцюг Н⁺ (видалення Н⁺ від молекул органічних речовин).

Для керування процесами формоутворення в культурі тканин необхідні біологічні регулятори росту і розвитку - фітогормони. Ці речовини впливають на диференціацію і дедиференціацію клітин і тканин, ініціюють гістогенез, індукують ділення і розтягування клітин, беруть участь в процесах старіння і дозрівання, або стимулюють чи інгібують ріст та розвиток клітинних культур, обумовлюють формування статі. У біотехнологічних дослідженнях частіше використовують гормони, які стимулюють ріст і розвиток: ауксини, цитокініни, гібереліни.

Ауксини: ІОК - β-індоліл-3-оцтова кислота, ІМК - індоліл-3-масляна кислота, НОК - α -нафтилоцтова кислота, 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота.

Цитокініни: кінетин - 6-фурфуриламінопурин, зеатин, NN -дифеніл-сечовина, 6-БАП - 6-бензиламінопурин.

Гібереліни: гіберелова кислота.

Як біологічні добавки для індукції первинного калусу можна використовувати рослинні екстракти (10-15 % від загального об'єму середовища): кокосове молоко (рідкий ендосперм кокосового горіха), витяжки з незрілих зерен кукурудзи (краще в період молочної стиглості), які містять цитокініни, - кінетин і зеатин (6-ти заміщені амінопурини) і NN –дифенілсечовину.

У культурі in vitro застосовують рідкі і агаризовані (тверді) середовища. Рідкі середовища використовуються для культивування суспензій, калусів, ізольованих органів і тканин, рослин-регенерантів. При цьому для підтримки експлантів в пробірки з середовищем поміщають спеціальні містки-підтримки з фільтрувального паперу або синтетичних пористих матеріалів.

Агаризовані середовища готують на основі агар-агару - полісахариду, який входить до складу морських водоростей і який утворює з водою гель при pH 5,6-6,0. Іноді як загущувач і замінник агар-агару використовують поліакриламідні гелі (біогелі) P10 і P200.

Для штучних поживних середовищ розчини макро- та мікросолей готують заздалегідь і використовують багаторазово. Це маточні (концентровані) розчини. Їх зберігають в спеціальних умовах: макро- і мікросолі в холодильнику в посудинах з притертими корками при 0…+4^оС; вітаміни, фітогормони, ферменти, рослинні екстракти - при -20^оС в невеликих, по 5-10 мл ємностях з корками (пеніцилінові флакони).

Маточні розчини макросолей зазвичай перевищують робочі в концентрації в 10-40 разів, мікросолей - в 100-1000 разів, вітамінів - в 1000 разів.

Розчини фітогормонів бажано готувати безпосередньо перед роботою з середовищами.

Для приготування маточного розчину макро- і мікросолей, кожну сіль розчиняють в окремій скляночці при нагріванні, потім зливають і доводять до потрібного об'єму. В охолоджену суміш мікросолей останнім додають розчин солей молібдену, а в макросолі - розчин солей магнію (для запобігання випадання осаду).

Маточні розчини хлористого кальцію і хелату заліза (сірчанокисле залізо + ЕДТА, або Na ЕДТА - трилон Б) готують і зберігають окремо від інших солей.

Концентровані розчини вітамінів готують таким чином: 10-кратні наважки розчиняють в 10 мл дистильованої води кожну окремо.

Фітогормони - це речовини, які погано розчиняються у воді. Тому попередньо 100 мг речовини розчиняють в невеликих кількостях (0,5-2,0 мл) спирту (ауксини, гібереліни), 0,5-1н HCl або КОН (цитокініни), потім підігрівають до повного розчинення (окрім абсцизової кислоти і кінетину) і доводять до 100 мл об'єму (1 мл містить 1 мг речовини).

 

Матеріали і устаткування. Хімічні склянки, колби, мірні циліндри від 5 мл до 2 л, пробірки, піпетки від 0,01 мл до 10 мл або дозатори, ваги аналітичні до 500 г, ваги торсійні до 100 мг, пінцети, ножиці, шпателі, електроплитки, магнітні мішалки, хімічні реактиви або готові маточні розчини макро- і мікросолей, вітамінів, фітогормонів.

 

Хід роботи.

1. У хімічну склянку місткістю 2 л помістити 20 г сахарози, долити дистильованої води до 400 мл і розчинити.

2. Додати до розчину сахарози 50 мл маточного розчину макросолей, 1 мл мікросолей, 5 мл хелату заліза, 5 мл хлористого кальцію.

3. Приготувати агар: наважку 7 г помістити в склянку і залити водою до 200 мл, розчинити, нагріваючи на плитці або газовому пальнику, при постійному перемішуванні. Готовий агар долити до розчину солей.

4. Поживне середовище довести до потрібного об'єму (1 л) дистильованою водою. Виміряти pH середовища: якщо pH перевищує 5,5-6,0 додати декілька крапель 0,1 н HCl, якщо нижче за це значення - 0,1 н КОН.

5. Готове поживне середовище розлити в пробірки на 1/3 об'єму, закрити пробірки ватними корками, помістити пробірки в металеві штативи.

6. Штативи з пробірками загорнути в целофановий папір (щоб в автоклаві не відкрилися корки).

7. Помістити штативи з пробірками в автоклав і проавтоклавувати.

 

Робота 3. МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ

Теоретичні відомості

Усі роботи з культурою клітин і тканин in vitro проводять в стерильних (асептичних) умовах в стерильному боксі або ламінар-боксі, стерильними інструментами, в стерильному посуді, на стерильних поживних середовищах. У разі порушення стерильності на середовищах добре розвиваються мікроорганізми (гриби, бактерії), створюються умови, при яких порушується склад і пригнічують ріст рослинних експлантів.

Найчастіше для стерилізації приміщень (боксів для пересадки тканин, культуральних кімнат) використовують ультрафіолетове опромінення протягом 0,5-2 годин (залежно від площі приміщення). Роботи в опроміненому приміщенні починають через 15-20 хвилин після відключення бактерицидних ламп, оскільки під дією ультрафіолетового випромінювання двоатомний кисень повітря стає трьохатомним озоном - газом, токсичним для людини. Для досягнення максимальної стерильності перед обробкою УФ усі поверхні ретельно миються миючими засобами, водою і розчинами хлоровмісних речовин, поверхні ламінар-боксу обробляють 96 % спиртом.

Посуд, халати, вату, папір, дистильовану воду, поживні середовища стерилізують в автоклавах під тиском пари 1-2 атм і температурою 120^оС протягом 20-60 хв, залежно від об'єму матеріалу, що стерилізується.

Колби, штативи з середовищем, вату, папір, халати перед автоклавуванням завертають в целофановий папір, або поміщають в бюкси.

Металеві інструменти автоклавувати не можна, оскільки під дією пари утворюється іржа. Тому їх стерилізують сухим жаром в термостатах з температурою 170-250^оС протягом 1-2 годин.

 

 

Матеріали і устаткування. Чашки Петрі, колби з дистильованою водою, штативи з пробірками, заповненими поживним середовищем, препарувальні голки, пінцети, скальпелі, вата, марля, папір: фільтрувальний і целофановий.

 

 

Хід роботи.

1. Металеві інструменти загорнути в щільний папір і помістити в сушильну шафу для стерилізації сухим жаром при t=170-200^oС протягом 2 годин.

2. Чашки Петрі, штативи з пробірками, заповненими поживним середовищем, вату, марлю, фільтрувальний папір, колби з дистильованою водою (закриті фольгою) загорнути в целофановий папір і помістити в автоклав.

3. Автоклав привести в робочий стан: закрити щільно кришку, воду залити до мітки. Включити автоклав, тиск пари довести до мітки 1,2 атм. (у паровій камері) заповнити парою камеру стерилізації, витіснити конденсат протягом 10 хв., при цьому тиск пари в камері стерилізації має бути на рівні 0,1-0,2 атм. Довести тиск в камері стерилізації до 1 атм., включити автоматичний режим.

4. Автоклавувати 20 хв. при тиску в камері стерилізації 1-1,2 атм.

5. Відключити автоклав, витіснити пару з обох камер, довести тиск до 0 атм.

6. Проавтоклавувальні матеріали перенести в кімнату для пересадки тканин і помістити в шафи або на стелажі.

 

Робота 4. СПОСОБИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ РОСЛИННИХ ЕКСПЛАНТІВ

 

Теоретичні відомості

З метою отримання експлантів для калусної і пухлинної культур, мікроклонального розмноження, вивчення гормональної регуляції використовують стерильні проростки. Насіння для пророщування висівають або на воду, або на поживне середовище.

Рослинні об'єкти перед стерилізацією ретельно відмивають проточною водою, іноді з миючими засобами, очищають від зайвих тканин. З коренеплодів і коріння знімають шкірку, з пагонів - кору, з бруньок – покривні луски.

Рослинні експланти стерилізують розчинами речовин, що містять активний хлор (хлораміном, гіпохлоритом Са і Nа, сулемою), бром (бромистою водою), перекисом водню, спиртом, нітратом срібла, діацидом, антибіотиками. Етиловий спирт часто застосовують для попередньої стерилізації, протираючи ним поверхню матеріалу або занурюючи матеріал на декілька секунд в абсолютний спирт. Іноді такої стерилізації вистачає, її використовують при роботі з плодами, насінням, пагонами, зав'язями.

Гіпохлорит кальцію (хлорне вапно) використовується у вигляді 5-7 % розчину для обробки бруньок, зав'язей, квіток, насіння, пагонів протягом 5-8 хвилин. Гіпохлорит натрію використовується у вигляді 0,5-5 % розчину для обробки будь-яких експлантів протягом 1-20 хвилин. Ця речовина є клітинною отрутою, тому час стерилізації і концентрацію підбирають експериментально. Наприклад: для ізольованих зародків використовують 2-3 % розчин протягом 10-15 хвилин, а для сухого насіння 3-5 % розчин протягом 1 години. Залишки гіпохлориту натрію спочатку видаляють 0,01 н HCl, а потім 8 разів промивають автоклавувальною дистильованою водою.

Хлорамін застосовують в концентрації 1-6 %. Пильники і молоді зародки обробляють протягом 1-3 хвилин, сухе насіння - 30-60 хвилин, потім промивають стерильною дистильованою водою 2-3 рази.

Сулема - токсична речовина і вимагає особливої ретельності, як при зберіганні, так і при виборі концентрації для окремих об'єктів. Для стерилізації зародків використовують 0,1 % розчин протягом 1-3 хвилин, для корене- і бульбоплодів - до 10-20 хвилин.

Розчини, що містять активний хлор використовуються 1 раз і готують їх безпосередньо перед роботою.

Діацид використовується в 0,2 % розчині для стерилізації коренеплодів, насіння, шматочків тканин, верхівкових меристем, ізольованих зародків, пильників. Діацид готують, розчиняючи окремо 330 міліграм етанолмеркурхлориду і 660 міліграм цетилпіридинію хлориду в гарячій воді (330 мл), потім їх змішують і доводять об'єм рідини до 1 л, додають декілька крапель детергента твін- 80; зберігають в щільно закритій колбі в темряві.

Антибіотики застосовують для стерилізації рослинного матеріалу, інфікованого бактеріями (тканини корончатогалових пухлин). Найчастіше застосовують стрептоміцин і тетраміцин 10-80 мг/л, ампіцилін 200-400 мг/л, левоміцитин, каноміцин і інші.

 

Матеріали і устаткування. Стерильні чашки Петрі, колби з автоклавованою дистильованою водою, флакони із стерилізуючими розчинами, зернівки пшениці і тритікале, ламінар-бокс, флакон з 96 % спиртом, вата, спиртівка, пінцети, фільтрувальний папір.

 

Хід роботи.

1. Відібрати 30 здорових зернівок пшениці або тритікале.

2. У ламінар-бокс помістити насіння в чашки Петрі із стерилізуючими розчинами по 5 насінин в кожну (6 % хлорамін, 6 % гіпохлорит кальцію, 96 % спирт, сулема 0,1 %, ампіцилін 400 мг/л, вода). Час стерилізації підібрати експериментально.

3. Відмити насіння від стерилізуючих розчинів дистильованою автокла-вованою водою.

4. Помістити насіння для пророщування в стерильні чашки Петрі на стерильний фільтрувальний папір в невелику кількість стерильної дистильованої води. Чашки Петрі закрити і перенести в термостат для пророщування.

5. Результати досліду замалювати через тиждень. Зробити висновки про ефективність стерилізуючих розчинів.

 

 

Робота 5. ТЕХНІКА РОБОТИ В ЛАМІНАРІ ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ СТЕРИЛЬНИХ ПРОРОСТКІВ.

 

Теоретичні відомості

Для культивування стерильних проростків необхідно використовувати ламінар-бокси, що забезпечують посадку експлантів на поживне середовище без зараження мікроорганізмами.

Усі поверхні ламінару обробляються 96 % спиртом, простерилізовані інструменти, матеріали, рослинний матеріал поміщають на стіл ламінару і вмикають УФ-випромінювання. Через 20 хвилин вимикають УФ і включають біофільтри. Для роботи в ламінар-боксі надівають стерильний халат і шапочку, руки обробляю 96 % спиртом. Пінцети, скальпелі і препарувальні голки поміщають в склянку з 96 % спиртом. Перед кожною маніпуляцією інструменти обпалюють на полум'ї спиртівки.

 

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, пробірки з поживними середовищами, стерильні препарувальні голки, пінцети, скальпелі, флакон з 96 % спиртом, спиртівка, вата, 6 % розчин хлораміну, колби з автоклавованою дистильованою водою, чашки Петрі, зернівки пшениці.

 

Хід роботи.

1. Відібрати 10 здорових зернівок пшениці, помістити в 6 % розчин хлораміну на 5 хвилин, промити стерильною дистильованою водою.

2. Зернівку помістити на стіл ламінару борозенкою вниз.

3. Однією препарувальною голкою притримувати зернівку, іншою - надрізати оболонку навколо зародка.

4. Бічною частиною голки натиснути на зародок (на межі з ендоспермом) і вичленувати його із зернівки.

5. Зародок помістити в чашку Петрі із стерильною дистильованою водою.

6. Узяти зі штативу пробірку з поживним середовищем, обпалити шийку над спиртівкою, зняти пробку. Пробірку тримати відкритою частиною від себе.

7. Препарувальною голкою перенести зародок на поверхню поживного середовища щитком вниз (не заглиблювати).

8. Пробірку і шийку пробірки обпалити на полум'ї спиртівки, пробірку закрити.

9. Пробірки із зародками поставити в штатив і перенести на стелаж в культуральну кімнату.

10. Проростки пшениці замалювати через 1-2 тижні. Оцінити якість посадки.

 

Контрольні питання до теми 1.

1. Як влаштована біотехнологічна лабораторія?

2. Як простерилізувати поживні середовища, посуд, дистильовану воду, інструменти, приміщення лабораторії?

3. Які стерилізуючі розчини використовуються для рослинних експлантів?

4. Які речовини входять до складу поживних середовищ, і яку функцію вони виконують в культурі клітин і тканин in vitro?

5. Як отримують стерильні проростки і для чого їх використовують?

 

 

Тема 2. МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН І