Концентрирование и очистка вирусных препаратов.

 

Очистка вирусов обычно осуществляется в три стадии:

1) осветление клеточного лизата;

2) концентрирование вирусной суспензии;

3) собственно очистка концентрированной суспензии.

Осветление нативных культуральных жидкостей проводится с целью удаления из них остатков клеток, упрощения дальнейшей очистки, и для облегчения эффективной обработки вирусов инактивирующими агентами. Осветление осуществляется методами фильтрации и центрифугирования. Часто оба указанных метода применяются в сочетании друг с другом, причем фильтрация сопровождает непрерывное центрифугирование.

Существует много способов концентрирования и очистки вирусов. Наиболее распространенные:

1. Методы преципитации. Преципитация (осаждение) нейтральными солями или органическими растворителями была первым методом, который применялся в крупномасштабном производстве очищенных вирусов, хотя многие вирусы более или менее нестабильны в присутствии органических растворителей.

2. Адсорбция-элюирование. Разработан процесс очистки и концентрирования, основанный на адсорбции вирусных частиц к нерастворимому комплексу, образуемому высокомолекулярным полимером этиленоксидом и ионами кальция. Сформированный с частицами вируса тройной комплекс выводится из системы преципитацией, а затем выделяется из смеси центрифугированием.

3. Ультрафильтрация. Ультрафильтрация представляет собой процесс, с помощью которого смесь веществ различной молекулярной массы в жидкой фазе подвергается разделению при прохождении ее под давлением через мембраны, имеющие определенный размер пор. Разделение происходит главным образом в зависимости от размеров молекул. Ультрафильтрация очень широко применяется для концентрирования вирусов и замены водной фазы вирусных суспензий перед дальнейшей очисткой.

4. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Применяется для полной очистки вирусов. Для использования градиентов плотности используют несколько сред, наиболее часто - сахарозу и хлорид цезия.

5. Метод ионообменной хроматографии. Концентрирование и очистку вирусов можно проводить с помощью колоночной ионообменной хроматографии. В качестве ионообменников обычно используют иониты, приготовленные на основе целлюлозы: ДЭАЭ, ТЭАЭ, эктеола и др.

6. Хроматография вирусов по размерам. Применяют сефадексы (молекулярные сита), которые позволяют разделить вирусы по величине частиц.

 

Оценка чистоты вирусных препаратов. Определение степени чистоты сложных субстанций (вирусные частицы) представляет значительные технические трудности. Гомогенный или монодисперсный, препарат вируса -это препарат, состоящий из частиц, однородных по размерам, форме, электрофоретической подвижности, плотности и антигенным свойствам. Эти критерии и лежат в основе методов, применяемых для проверки чистоты вирусных препаратов.

Для определения чистоты вирусных препаратов применяют следующие методы:

- электронная микроскопия вирусных частиц;

-аналитическое ультрацентрифугирование;

- аналитический электрофорез;

- центрифугирование в градиенте плотности.

В случае вирусных иммунобиологических препаратов, где очень сложная природа вирусных частиц может сделать трудными для оценки многие физико-химические критерии чистоты, главнейшей задачей очистки является удаление нежелательных иммуногенных и инфекционных материалов. В случаях, когда необходимо убедиться в отсутствии потенциальных контаминантов, таких, как сыворотка крови животных, наиболее подходящими являются серологические методы. Они в совокупности с другими физическими, химическими или биологическими тестами, придающими оценке препарата законную силу, составляют основу спецификации продукта.

 

Инактивация вирусов

При изготовлении некоторых препаратов (вакцин) вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Трудности производства инактивированных вакцин заключаются в необходимости строгого контроля за полнотой инактивации вируса. Методы инактивации делят на две общие группы: физические и химические. Наиболее часто в промышленном производстве используют химические методы.

Широкое применение в качестве инактивирующего агента получил формальдегид; для производства противоящурных вакцин во всем мире широко применяются азиридины; для инактивации вирусов ящура, болезни Ньюкасла, бешенства энцефалитов лошадей и др. используют β-пропиопактон.

Поскольку инактивирующие агенты легко реагируют с невирусными белками и некоторыми компонентами питательных сред, при выборе концентрации инактиванта необходимо учитывать степень чистоты препарата.

Физические инактивирующие агенты имеют ограниченное применение: ультрафиолетовый свет и ионизирующая радиация инактивируют нуклеиновые кислоты вирусов, при их применении необходимо учитывать, что повышение дозы облучения ведет к снижению антигеннности препарата. Тепловое воздействие на вирусы в целях уничтожения их инфекционности при сохранении иммуногенности также ограничено. Температура часто играет роль критического фактора при инактивации вирусов с применением химических средств.