Среды, применяемые для культивировании клеток

Сейчас в редких лабораториях культуральные среды составляются из индивидуальных компонентов в самой лаборатории. Если даже требуется специальная среда, лишенная той или иной аминокислоты, то и такую среду можно найти в каталогах промышленных фирм.

Повышенная стоимость таких сред перекрывается удобствами использования стандартных коммерческих сред (для всех производственников и исследователей, за исключением тех, которые сами изучают культуральные среды).

По этой причине не приводятся детальные методы составления сред из индивидуальных компонентов. Следует лишь иметь в виду, что вода, используемая для приготовления среды, должна быть вначале деионизована и затем перегнана в стеклянной посуде хотя бы один раз, и после этого она должна храниться в стеклянном или пластиковом контейнере.

В ранних исследованиях поддержание роста клеток обычно обеспечивалось экстрактами эмбриональных и взрослых тканей, но в настоящее время такие экстракты редко добавляются в культуральную среду - и то лишь для культивирования определенных первичных клеток.

Среда, используемая в наше время, помимо аминокислот, витаминов, солей и глюкозы, включает в себя. Как правило, сыворотку млекопитающих (до 10%), а в ряде случаев и другие добавки, такие, как бакто-пептон и триптозофосфат.

Начиная со среды 199, содержащей более 60 синтетических ингредиентов, в свободную продажу стали поступать и культуральные среды другого состава.

В 1955 г. Игл провел качественный и количественный анализ компонентов, обеспечивающих рост нескольких линий клеток млекопитающих. Предложенная им основная среда содержит 28 ингредиентов и требует добавления 5% сыворотки крупного рогатого скота.

Позднее Игл модифицировал эту среду, что позволило избежать ежедневной смены среды для поддержания роста культуры; эта минимальная среда Игла широко используется до настоящего времени.

В ряде исследований были предложены дальнейшие модификации среды Игла. Так, среда MEM Глазго, содержащая удвоенные по сравнению с БСИ концентрации аминокислот и витаминов и дополнительно глюкозу и бикарбонат, рекомендована для выращивания клеток хомячков ВНК21/С13.

МСИ в модификации Дюльбекко отличается от БСИ в 4 раза более высокой концентрацией аминокислот и витаминов, а также присутствием некоторых заменимых аминокислот и Fe(NO)₃)3. Эта среда рекомендована для размножения вируса полиомы в клетках хомячка.

Сбалансированные солевые растворы. Среды составляются на основе сбалансированных буферных солевых растворов (СБСР), которые, помимо снабжения клеток необходимыми ионами, важны также для поддержания осмотического баланса.

В некоторых случаях в сбалансированный раствор солей добавляется глюкоза. Однако лучше добавлять стерильный раствор глюкозы вместе со стерилизованным в результате фильтрования раствором бикарбоната натрия после того, как остальные ингредиенты будут стерилизованы путем автоклавирования.

Состав солевых растворов модифицировался в течение многих лет, и в настоящее время наиболее употребительными оказываются СБСР Эрла, СБСР Хэнкса и специальный СБСР, предложенный Иглом для суспензионных культур. Они поставляются обычно в форме 10-кратных концентратов без бикарбоната. Такой исходный раствор разбавляют дистиллированной водой и автоклавируют, после чего в него добавляют бикарбонат и глюкозу.

Весьма важно поддерживать правильное значение рН культуральной среды в диапазоне 7,2 - 7,5, что достигается обычно с помощью системы бикарбонат/С0₂. При концентрации С0₂ в воздухе 5% эта система обеспечивает рН среды 7,4 (при этом рН среды, благодаря присутствующему в ней феноловому красному, окрашена в темно-красный цвет). При подщелачивании среды ее цвет меняется на красный и далее на пурпурно-коричневый, а при подкислении среды она становится желтой.

Поскольку растущие клетки вырабатывают кислоту, в некоторых случаях возникает необходимость увеличения концентрации бикарбоната в среде для обеспечения поддержания надлежащего рН. Фосфаты в СБСР также способствуют поддержанию рН и, кроме того, обеспечивают клетки необходимыми для них ионами фосфора.

Ионы Na⁺ и в меньшей степени К⁺, будучи незаменимыми в некоторых внутриклеточных реакциях, имеют важное значение также для поддержания осмотического баланса клеток. Изотоническая концентрация ионов Na⁺ в СБСР обеспечивается главным образом NaCl, но в СБСР Эрла источником Na⁺ служит также NaHC0₃, а в меньшей степени и другие соли. Увеличение концентрации Na от 120 мМ (нормальной) до 220 мМ ведет к диссоциации полирибосом с последующим ингибированием синтеза белка и роста клеток.

Ионы Са²⁺ необходимы для прикрепления клеток к стеклянной или пластиковой поверхности и в связи с этим не входят в состав СБСР для суспензионных культур; в таких СБСР концентрация фосфата увеличивается обычно в 10 раз.

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) Дюльбекко сходен с СБСР Хэнкса, но в ФСБ отсутствует бикарбонат, а содержание Na2HP04 и КН₂Р0₄ повышено для обеспечения большей буферной емкости. ФСБ не используется в качестве основы для культуральных сред, но часто применяется для промывки клеточного монослоя.