Тема 10. Гибридомная технология и моноклональные антитела

 

Новый мощный стимул культурально-тканевые методы получили в результате разработки гибридомной и ДНК-рекомбинантной технологий, с помощью которых удалось осуществить получение нового спектра биопрепаратов и удешевить производство многих традиционных биологически активных веществ.

Необходимо отметить достижения в гибридомной технологии, на базе которой удалось осуществить производство широчайшего спектра лечебных и диагностических моноклональных антител.

По мнению Р.Спиер и Ф.Хорауд, моноклональные антитела могут обеспечить дальнейший прогресс в области специфического диагноза заболеваний.

В 1975 г. Д.Келер и Ц.Милштейн осуществили слияние плазмацитомы (опухоли, возникшей из антителообразующей клетки или ее предшественника) с клетками селезенки иммунизированного животного, получив таким образом гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки -синтезировать антитела предопределенной специфичности.

Гибридомные линии клеток могут выращиваться в суспензии и являются теоретически бессмертными, если они имеют субстрат для роста в непрерывной культуре в течение неограниченного периода времени.

Общая схема получения гибридом на основе миеломных клеток и иммунных лимфоцитов включает следующие этапы:

1. Получение опухолевых клеток, погибающих при последующей селекции гибридомных клеток.

2. Получение лимфоцитов - продуцентов антител к заданным антигенам. Животное (мышь, реже крысу, кролика) иммунизируют введением антигена в брюшную полость, внутривенно или подкожно. Для получения человеческих гибридом прибегают к иммунизации лимфоцитов человека в культуре ткани, что является более сложной и многоэтапной процедурой.

3. Слияние лимфоцитов с опухолевыми клетками. Сливающим агентом служит полиэтиленглиголь, реже лизолецитин или вирус Сендай, а также электрическое поле. Для успешного слияния клеток мышей и человека последние предварительно обрабатывают проназой, нейраминидазой или диспазой.

4. Скрининг гибридомных клеток. Применяют селективную среду ГАТ, содержащую гипоксантнн, аминоптерин и тимидин. На этой среде родительские миеломные клетки погибают как генетически дефектные по ферментам запасных путей биосинтеза нуклеотидов. Родители-лимфоциты, не слившиеся с миеломными клетками, тоже погибают, поскольку они не способны расти вне организма в заданных условиях. Гибридомные клетки сочетают в себе способность к неограниченному росту и к синтезу нуклеотидов по запасным путям и поэтому накапливаются в культуре.

5. Проверка способности гибридомных клеток продуцировать моноклональные антитела к заданному антигену. Для этого используют метод иммуносорбентов. Образец культуральной жидкости с клетками вводят в реакцию с соответствующим антигеном, прочно закрепленным на носителе. Для распознавания комплекса антиген - антитело к используемым антителам получают вторые антитела путем иммунизации этими иммуноглобулинами животного (например, иммуноглобулины мыши вводят в организм козы). Эти вторые антитела ковалентно связывают с каким-либо ферментом (например, с пероксидазой). Если вырабатываемые гибридомой антитела действительно связывают заданный антиген, то добавление к ним вторых антител с пришитым ферментом ведет к образованию комплекса антиген - моноклональное антитело-антитело к моноклональному антителу -фермент. Последующее добавление субстрата, соответствующего ферменту, запускает ферментативную реакцию, протекание которой регистрируется по образованию ярко крашенного продукта.

6. Клонирование гибродомных клеток, прошедших проверку на образование моноклональной антител, с постоянным контролем на стабильность их иммунных свойств.

7. Массовое культивирование гибродомы, выделение, концентрирование и очистка продуцируемых антител.

Поскольку гибродомы можно хранить в замороженном состоянии, в некоторых институтах и лабораториях созданы гибродомные банки.

Благодаря использованию моноклональных антител, полученных в результате иммунизации животных различными вакцинами, стало возможным определение дозы этих вакцин.

В мае 1981г. управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA) впервые утвердило к продаже набор для диагностического скрининга на основе гибридом, предназначенный для установления аллергена. Такие же наборы уже созданы для тестирования гормонов, диагностики вирусных заболеваний и обнаружения некоторых видов рака.

С помощью моноклональных антител возможно также выделение биологически активных веществ (белков, гормонов, токсинов) из сложных смесей.

Слияние Т-лимфоцита-киллера с опухолевой клеткой дает клон неограниченно размножающихся клеток, выслеживающих определенный антиген-тот, к которому был специфичен взятый Т-лимфоцит. Подобные Т-киллерные гибридомные клоны используют для уничтожения раковых клеток непосредственно в организме больного.