Генетическое конструирование микроорганизмов: транспозоны.

Транспозируемые элементы – дискретные элементы ДНК, переносимые в приделах репликона (участок способный к воспроизведению) или от одного репликона кт к другому. Истинные транспозоны –Is-элемнеты, включают 200-2000 последовательностей нуклиотидов. Транспозоны Tn – могут переносить целые гены но не большие. Tn 5 – кодирует информацию резистентности к хлоромицину. Так же есть Tn 9 транспозон. Фаг µ транспозон. Фаги включаются в клетку в различные репликоны. Перемещающиеся элементы отличаются по степени специфичности:

1) высоко специфичные - интеграция возможна в один или несколько сайтов;

2) элементы региональной специфичности - интеграция возможна в различные сайты одного района;

3) элементы средней специфичности – интеграция во многие сайты, с меньшим предпочтением одного из них;

4) элементы низкой специфичности – каждый раз перенос происходит в новый сайт.

При увеличении гена на 1000 олигонуклиотидов скорость уменьшается в 2 раза. На перемещение влияет: температура, ультрофиолетовое излучение. Транспозиции:

1) репликативная – слияние донорной и реципиентной ДНК идет с участием фермента транспозазы, далее идет разделение с участием разолвазы.

2) Консервативная – выщепление перемещающейся молекулы донора и внедрение его в молекулу реципиента идет за счет ферментов клетки хозяина.

При перемещении элементов могут возникать - делеции, инверсии, дупликации, транслокации.

Транспозонный мутагенез – метод создания новых промышленных штаммов микроорганизмов. Преимущества перед химическим мутагенезом:

1) при высокой частоте мутаций не происходит гибели организмов;

2) мутации одноступенчатые, сопровождаются утратой функций;

3) в районе репликации обнаруживается делеция;

4) возможно такое выпадение транспозона и постановление функции утраченного гена;

5) возможно добавить свойства без утраты функционирования гена (точная локализация). Транспозоны обеспечивают гомологичную рекомбинацию между не гомологичными участками.

не влияют на репликацию, туда и производят внедрение.

15.Произв-во кормового и пищевого белка. Дефицит кормового белка сдерживает развитие живот-ва. Биологическая ценность белка определяется содержанием в нем незаменимых аминокислот (валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин). Недостаток какой – либо из АК в кормах лимитирует усвояемость остальных, приводит к перерасходу кормов и должен компенсироваться концентрированными кормами. Среди зерновых и зернобобовых культур наиболее сбалансирован по содержанию незаменимых аминокислот белок зерна сои, риса и гороха. В белках зерна пшеницы и ячменя содержится мало лизина, метионина и изолейцина, а в белках зерна кукурузы - триптофана. Одним из путей решения проблемы кормового белка является получение его микробиологическим путем. (дрожжи, бактерии, низкие и высшие грибы и одноклеточные водоросли) М.о. отличаются высоким (до 60% сухой массы) содержанием белка, сбалансированного по АК составу.

Кроме того, м.о. содержат углеводы, липиды, витамины, макро- и микроэлементы. Важным достоинством производства кормового белка на основе м.о. является использование с/х отходов, возможность организации промышленного производства. Кормовые дрожжи получают на отходах деревообрабатывающей, кондитерской, молочной промышленности, сельского хозяйства, парафинов нефти.

Для получения кормовых дрожжей на растительном субстрате (отходы древесины, солома, льняная костра, картофельная мезга, свекловичный жом и др.). наиболее эффективны дрожжи родов (Candida, Torulopsis, Saccharomyces). Растительное сырье, содержащее целлюлозу и гемицеллюлозу, подвергается кислотному гидролизу, в результате чего более половины полисахаридов гидролизуется до моносахаридов.

Кормовые дрожжи выращивают в специальных ферментерах, где обеспечивается перемешивание суспензии микробных клеток в жидкой питательной среде и аэрация. затем культуральная жидкость вместе с клетками дрожжей выводится из ферментера, после чего дрожжи отделяются от жидкости, подвергаются специальной обработке для разрушения клеточных оболочек, упариваются и высушиваются. Субстратом для получения кормовых дрожжей могут служить парафины нефти (и спирты этанол и метанол) в сочетании с макро- и микроэлементами, витаминами и аминокислотами. в СССР годовой объем белково-витаминных концентратов (БВК) полученных из парафинов нефти, достигал 1 млн.т.

Весьма перспективно производство белково-витаминных продуктов при использовании технологических процессов на основе дрожжей, способных к росту на молочной сыворотке. Такой штамм дрожжей T. созданы технологии получения ряда кормовых препаратов на основе микробной переработки молочной сывортоки (Био-Зум, Промикс,.).Препараты ЗЦМ (заменители цельного молока) превосходят сыворотку по содержанию и качеству белка, а также витаминов. Каждая тонна использованного в животноводстве БИО-ЗЦМ высвобождает для пищевых целей 8 т цельного молока.

Производство БОО(белки одноклеточных организмов) имеет многие преимущества перед производством б-ка в живот-ве и раст-ве: 500 кг дрожжей дают за сутки 80 кг белков, а у быка того же веса суточный привес составляет в лучшем случае 500 г белка. Однако БОО используют в основном как корм для скота, и лишь в будущем можно ожидать создания технологий получения БОО, пригодных для питания человека. Перспективно в этом отношении культивирование некоторых грибов (Fusarium), зеленых водорослей (Chlorella), цианобактерий (Spirulina), имеющих адекватные для человека органолептические свойства. В настоящее время уже налажено производство на базе крахмала волокнистой массы Fusarium как источника пищи для человека.Изменения в генах, осуществленные с помощью генной инженерии, могут модифицировать структуру и улучшать свойства пищевых белков,.

 

16. Производство АК. Объем мирового производства аминокислот составляет более 500 тыс. т в год, В промышленных масштабах белковые АК получают:1) гидролизом природного белоксодержащего сырья; 2) химическим синтезом;3) микробиологическим синтезом;

4) биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

В ходе кислотного гидролиза б-в происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их АК. При кислотном гидролизе разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10–30%). недостаток методов химического синтеза АК состоит в получении целевых препаратов в виде рацемической смеси D- и L-стереоизомерных форм.

Наиболее перспективен микробиологический синтез АК. Более 60% всех производимых в настоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых АК. получают именно этим способом, преимущество состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.

Способности у м.о. выделять в культуральную среду АК. М.о. – Corynebacterium glutamicum был способен к сверхсинтезу глутамата (для производства глутаминовой кислоты).Распространенные объекты селекции рода Brevibacterium, Microcjccus, Corynebacterium, Arthrobacter.

Производство лизина. В клетках м.о. лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного метаболического пути биосинтеза, общего для трех АК – лизина, метионина и треонина.

Эффекта накопления в среде всего одной целевой АК добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных АК, возникающих в связи с разветвлением метаболического пути. L-лизина – Brevibacterium flavum и C.glutamicum.Чтобы добиться образования лизина в больших количествах, получают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезируется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результате чего блокируется синтез метионина и треонина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминирующему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора – лизина.

Производство триптофана. Подобно лизину триптофан образуется в ходе разветвленного метаболического пути, поэтому для его производства используют ауксотрофных мутантов, у которых блокированы реакции, ведущие к синтезу фенилаланина и тирозина. Триптофан оказывает ингибирующее действие на антранилатсинтетазу, поэтому

производство триптофана организовано преимущественно по двухступенчатой схеме. На первом этапе химическим способом синтезируют антраниловую кислоту, которую с помощью энзиматической системы мутантных штаммов дрожжей Candida utilis переводят в триптофан.

Кроме триптофана микроб-ким способом с использованием предшественников получают гистидин, изолейцин, метионин, серин и треонин. Для получения АК – конечных продуктов неразветвленных метаболических путей, например аргинина, ауксотрофные мутанты не используют. В этом случае применяют мутанты с дефектами регуляции биосинтеза АК, т.е. регуляторные мутанты.

 

17. Производство витаминов. Витамины представляют собой группу незаменимых органических соединений различной химической природы, необходимых любому организму В наст вр. создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время вит.. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению вит.: В2, В12, β-каротин (провитамин А) и предшественники вит.D. Остальные вит.либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химически.

Получение вит. В2 (рибофлавин). Вплоть до 30-х г. рибофлавин выделяли из природного сырья. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени – 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина – гриб Eremothecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В2. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами.

Среда культивирования- это соевая мука. Кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, витамины, технический жир. В качестве посевного материала используют споры E. Ashbyii(грибы) выращенные на пшене(8 дней) – это всё в ферментёр, процесс ферментации длиться 3 сут.

В 1983 г. сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризующийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез рибофлавина. Клонированием генов рибофлавинового оперона в одной из созданных плазмид был получен производственный штамм-продуцент вит. В2, способный синтезировать втрое большее по сравнению с E. ashbyii количество рибофлавина всего за 40 ч ферментации.

Получение витамина В12 (цианокобамид). из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг вит.. Единственный способ его получения в настоящее время – микробиол-кий синтез. механизмы регуляции биосинтеза витамина В12 до настоящего времени полностью не расшифрованы. Известно, что при высоких концентрациях вит. полностью репрессирует синтез ключевых ферментов своего новообразования.

Продуцентами витамина В12 при его промышленном получении служат актиномицеты, метанобразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли. пропионовокислые бактерии, известные ещё с 1906 г. и широко использующиеся при приготовлении препаратов животноводства. Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12.Среда культивирования- среда с глю, хлорид кобольта, витамины, неорган.соли, кукурузная мука. В качестве посевного материала используют культуры м.о. выращенных в спец аппаратах – это всё в ферментёр, куртуральную ж-ть упаривают в вакууму, сушат и смешивается с наполнителями.

Получение β-каротина и вит. D2. β-Каротин можно выделить из ряда растительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны. разработана схема микробиологического синтеза β-каротина, которая стала основой промышленного способа его получения. фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи – синтезируют каротин. Характерно, что содержание β-каротина у м.о. во много раз превышает содержание этого провитамина у раст.. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг β-каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora – 3–8 тыс. мкг.

Микробиологическим способом получают и вит. D2 (эргокальциферол), при производстве которого освоено дешевое сырье (углеводороды) и установлен стимулирующий эффект ультрафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей.

18. Производство органических кислот. уксусная кислота.при производстве используется способность некоторых м.о. окислять этанол. Этот процесс называют уксуснокислым брожением. В качестве сырья используются этанолсодержащие жидкости (вино, забродившие соки), либо же просто водный раствор этилового спирта^[11].Штаммы Acetobacter и gluconobacter.

Реакция окисления этанола до уксусной кислоты протекает при участии фермента алкогольоксидазы(алькоголь дегидрогеназы). Это сложный многоступенчатый процесс, который описывается формальным уравнением СН₃СН₂ОН + О₂ → СН₃СООН + Н₂О, протикает в анаэробных условиях в режимк непрерывного культивирования

Получение лимонной кислоты. Её широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Ею заменяют фосфаты в составе детергентов, так как она полностью метаболизируется живыми организмами. Лимонная к-та образует хелаты с металлами, поэтому её применяют для их очистки. Объем мирового производства цитрата составляет 400 тыс. т/год.

Для промышленного производства лим. К-ты используют культуру гриба Aspergillus niger и A. wentii.. Метаболическим источником лимонной кислоты в организме служит цикл трикарбоновых кислот. катализируемая цитратсинтазой, открывает цикл Кребса. Активность фермента зависит от концентрации ЩУК,

Питательные среды для культивирования продуцентов лимон­ной кислоты в качестве источника углерода содержат дешевое уг­леводное сырье: мелассу, крахмал и глюкозный сироп. Гриб A. niger чаще всего выращивают на мелассе. Существует несколько технологических вариантов промышлен­ного производства лимонной кислоты. Первоначально был разра­ботан вариант процесса, основывающийся на поверхностной фер­ментации, позднее — на глубинном культивировании. Последнее ведется в две стадии: на первой стадии идет рост мицелия, а на второй, после выхода культуры в стационарную фазу — интен­сивный синтез лимонной кислоты.

Одновременно с лимонной было налажено производство молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий рода Lactobacillus. Производство D-глюконовой кислоты из глюкозы при участии A.niger. Глюконат натрия, в виде которого обычно выделяют глюконовую кислоту, используют для извлечения металлов, борьбы со ржавчиной, как моющее средство и в качестве медицинского препарата.

Производства, основанные на ацетон-бутанольном брожении и микробиологическая конверсия этанола в ацетат в настоящее время не рентабельны по экономическим соображениям.