Инструментальные методы микробиологического анализа

Лаборатории предприятий пищевой и перерабатывающей промышленности, испытательные и сертификационные центры нуждаются в быстрых, простых и дешевых методах микробиологического анализа сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов.

За последние 30 лет был предложен ряд инструментальных методов микробиологического анализа, но наибольшее распространение получили электрические, оптические, теплометрические методы.

К инструментальным методам относятся:

1 Микроскопический счет клеток в окрашенных препаратах. Сущность метода заключается в нанесении микрокапли исследуемого материала на поверхность предварительно расчерченного предметного стекла, фиксации материала с последующим окрашиванием препарата и микроскопического подсчета клеток. Зная объем капли, кратность разведения взвеси и величину площади подсчитанной поверхности модно легко определить концентрацию клеток, содержащихся в исследуемом образце. Многочисленные модификации метода касаются способов отмеривания объема наносимой капли, техники приготовления мазка, окрашивания и микроскопического счета клеток. Основные трудности при использовании этих методов связаны с точным отмериванием малых объемов взвеси (в среднем 0,01 мл) и равномерным распределением материала по стеклу, поскольку подсчет проводится не по всей поверхности мазка, а выборочно. Наиболее совершенным методом является метод микроскопического счета в окрашенных мазках по Бриду. С помощью микропипетки, микрошприца или специальной микропетли наносят каплю исследуемой суспензии, объемом 0,01 мл на предметное стекло. Размазывают каплю по стеклу так, чтобы она заняла площадь примерно 1 см². Для этого можно подложить под стекло миллиметровую бумагу. Мазок подсушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки или 95% этаноле. Окрашивают метиленовым синим и тщательно промывают препарат. С помощью микроскопа с иммерсионным объективом подсчитывают клетки в несколькиз полях зрения (не менее 10), двигаясь по диагонали мазка. Диаметр поля зрения иммерсионного объектива составляет около 0,16 мм. Формула для подсчета концентрации клеток в исследуемой суспензии имеет следующий вид:

[C]= N*4*10⁴/ 3,14*D²

где N – количество клеток в поле зрения;

D – диаметр поля зрения.

2 Флуоресцентные метод. Микробные клетки способны адсорбировать люминесцентные красители. Суспензии, содержащие окрашенные клетки. Будут светиться в ультрафиолетовом свете. Интенсивность такого свечения обычно находится в прямой линейной зависимости от концентрации окрашенных клеток. Следовательно, регистрируя в флуориметре интенсивность свечения суспензии клеток, окрашенных каким-либо люминесцентным красителем, можно по предварительно составленной калибровочной шкале определить их концентрацию.

3 Фотометрический метод. Суспензии микроорганизмов относятся к оптически неоднородным средам. Проходя через такую среду. Световой поток рассеивается частицами дисперсной фазы – микробными клетками. Феноменология процесса светорассеивания количественно выражается законом Бугера, определяемого уравнением:

I_x=I₀*

где I₀ – интенсивность падающего света;

– коэффициент ослабления;

I₀ – интенсивность света после прохождения расстояния х в мутной среде.

В случае бактериальной суспензии, практически не поглощающих видимого света, коэффициент ослабления целиком обусловлен рассеиванием и носит название мутности. Само же рассеяние обусловлено дифракцией светового луча при огибании клетки, его преломлением при прохождении через нее и отражением света от ее поверхности. Роль каждого из этих факторов в результирующем эффекте светорассеяния зависит от размеров, формы и оптических свойств клеток и дисперсионной среды. В целом же мутность микробных суспензий, при прочих равных условиях, определяется концентрацией содержащихся в суспензии клеток. На этой взаимозависимости между мутностью суспензии и концентрацией взвешенных в ней клеток и основаны все методы фотометрического анализа – от визуального определения мутности суспензий при помощи так называемых оптических стандартов, до инструментальных фотоэлектрических измерений их оптической плотности.

4 Колориметрический метод. Исследуемую суспензию микроорганизмов (дрожжей или бактерий) общей концентрацией примерно 3 г/л кипятят в течение 5 минут. После остывания к суспензии прибавляют раствор метиленового синего до конечной его концентрации примерно 100-200 мг/мл. смесь тщательно перемешивают и выдерживают в течение 5 мин при температуре 10-25⁰С. Центрифугируют до полного осаждения клеток. Надосадочную жидкость используют для колориметрических измерений в спектрофотометре при λ=440 нм. Для сравнения аналогичным колориметрическим измерениям подвергается контрольный раствор метиленового синего исходной концентрации.

5 Флуориметрический метод определения ДНК. Клетки осаждают центрифугированием и промывают фосфатным стерильным буфером рН 7,2. Осадок суспендируют в 4 мл раствора, содержащего 33% стерильного буфера и 67% 1н. NaOH. Суспензию энергично встряхивают и подвергают воздействию ультразвука в течение 1 ч. Добавляют 5 мкл 10^-3 М раствора этидиум бромида. Измеряют максимум флуоресценции с помощью флуоресцентного спектрофотометра при длине волны 619 нм. Концентрацию клеток в мсследуемом образце определяют по заранее вычисленной калибровочной кривой.

В настоящее время методы инструментального количественного анализа микробных суспензий используются исключительно широко как в лабораторной практике, так и в промышленных условиях. Важнейшими достоинствами этих методов являются простота процедур, быстрота манипуляций, возможность всесторонней их автоматизации и «неразрушающий» характер проводимых определений. Из недостатков следует отметить непригодность этих методов в случае нестабильных и агрегативно неустойчивых суспензий.