Теоретические основы биокалориметрического метода анализа

1.3.1 Биокалорииетрический метод определения общего количества микроорганизмов

Мезофильная аэробная и факультативно-анаэробная микрофлора наиболее широко распространена среди других форм микроорганизмов, и ее содержание является одним из основных показателей санитарно-гигиенической чистоты производства пищевых товаров. Экспресс методом определения КМАФАнМ в сельскохозяйственном сырье и продуктах питания является метод микрокалориметрии.

В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в пищевых продуктах происходит потребление питательных веществ и выделение тепла в окружающую среду. Количество выделенного тепла пропорционально содержанию клеток и их физиологической активности. При помещении образца с пробой пищевого продукта в микрокалориметр типа Тиана-Кальве выделяющиеся тепло передается через теплопроводящую стенку кюветы микрокалориметра к тепломеру, а также частично рассеивается в окружающую среду. Зарегистрированное значение теплового потока q будет меньше истинного значения f на величину рассеянной тепловой мощности. Кроме того, изменения q будут запаздывать во времени на величину τ относительно изменений f. Согласно основному динамическому уравнению микрокалориметров типа Тиана-Кальве, связь между истинным и регистрируемым тепловыми потоками описывается следующей формулой:

 

f(t) = q*(t-τ) + K*ʄ *q*(t-τ)*dt

 

где К – постоянная величина, характеризующая скорость теплообмена между ячейкой и термоблоком.

Скорость выделения тепла при жизнедеятельности микроорганизмов обычно значительно ниже, чем скорость распространения тепловой энергии к тепломеру. В этой связи для микробных клеток реализуется условие:

 

q*(t-τ) = f'(t)/К

 

Между удельным тепловым потоком и концентрацией клеток N_o микроорганизмов наблюдается зависимость вида:

 

f(t) = F* N_o*exp(m*t) + B* N_o

 

где F – среднее значение удельной тепловой активности делящихся клеток;

В – среднее значение удельной тепловой активности не делящихся клеток;

m – удельная константа скорости размножения клеток.

Из вышеприведенных формул следует, что регистрируемый тепловой поток зависит от концентрации клеток микроорганизмов в соответствии с уравнением:

 

q*(t-τ) = F* N_o* m*exp(m*t)/К

 

N_o = К* q*(t-τ)/ F* m*exp(m*t)

 

Полученная формула связывает зарегистрированную прибором тепловую мощность с концентрацией клеток в исследуемом образце, параметрами микрокалориметра и характеристиками физиологической активности клеток. Для практического использования данной формулы необходимо предварительно провести градуировку микрокалориметра на пищевом продукте с известным содержанием клеток.

Если содержание микроорганизмов в пищевом продукте находится в интервале 10⁵-10⁸ кл/см³, биокалориметрический анализ проводится в течение 30 минут. При оценке более низких концентраций бактерий необходимо предварительное выдерживание продуктов в термостате при температуре 30^оС либо 37^оС в течение 2,4,6 часов для дополнительного увеличения количества клеток. Если концентрация микроорганизмов в образце превышает 10⁸ кл/см³, перед измерением проводится разведение образца до рабочего диапазона концентраций 10⁵-10⁸ кл/см³.

ХОД РАБОТЫ.

После перемешивания жидкого пищевого продукта отбирают 20 см³ образца, разливают его поровну в 4 стерильные пробирки. Первую пробирку с образцом используют для определения микроорганизмов в диапазоне концентраций 10⁵-10⁸ кл/см³. Три другие пробирки помещают в термостат, для определения более низких концентраций.

Для микрокалориметрического анализа взятую пробу делят на две равные части и одну из частей подвергают тепловой обработке на кипящей водяной бане в течение 10 минут. После этого ее охлаждают и используют в качестве контрольной пробы, а необработанную часть – в качестве рабочей пробы.

Рабочую и контрольную пробы заправляют в подготовленной к измерениям микрокалориметр, термостатированный при 30^оС, и через 30 минут проводят отсчет показаний мощности теплопродукции клеток. Если полученная величина теплового потока превышает значение 15 кВт/см³, дальнейшие измерение прекращают и проводят расчет содержания микроорганизмов в образце.

Общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяют по формуле:

 

N₀ = q₀/F,

 

где q₀ – удельная мощность тепловыделения клеток микроорганизмов в анализируемом образце;

F – среднее значение коэффициента физиологической активности микроорганизмов, полученное в процессе градуировки микрокалориметра.

 

1.3.2 Биокалориметрический метод определения физиологической активности микроорганизмов

Физиологическая активность клеток с точки зрения обмена веществ измеряется количеством питательных субстратов, потребляемых единицей микробной биомассы за единицу времени, или количеством образующихся продуктов и выражается зависимостью:

А = a*m + b,

где А – физиологическая активность;

а – трофический коэффициент, показывающий затраты питательных веществ на образование единицы биомасс;

m – удельная константа скорости роста численности клеток;

b – коэффициент основного обмена, показывающий расход питательных веществ на подержания жизнедеятельности единицы биомассы за единицу времени.

Поскольку для определенной культуры клеток при фиксированных условиях среды коэффициенты а и b постоянны, физиологическая активность клеток линейно связана с их ростовой активностью и зависят от удельной константы скорости роста.

При интенсивном росте культуры клеток a*m b и удельная константа скорости размножения микроорганизмов характеризует их физиологическую активность.

При слабом росте культуры клеток a*m и их физиологическая активность определяется основным обменом.

Так как различные процессы жизнедеятельности микроорганизмов сопровождаются выделением тепла, то мерой физиологической активности клеток с энергетической точки зрения может являться скорость их тепловыделения, которая отражает как интенсивность протекающих метаболических реакций, так и скорость размножения клеток.

В основе биокалориметрии, как и других косвенных инструментальных метод анализа живых организмов, лежит зависимость величины регистрируемого сигнала от численности и физиологической активности клеток в анализируемом объекте.

Для быстрого определения общего количества микроорганизмов в пищевых продуктах микрокалометрическим методом требуется предварительно оценить удельную тепловую активность клеток в образцах с известным содержанием микроорганизмов. Процесс установления соответствия между показаниями прибора и содержанием микроорганизмов в образце называется градуировкой микрокалориметра. Теплопродукция микроорганизмов в пищевых продуктах зависит как от численности клеток, так и от особенностей их метаболизма и ростовой активности. На нее также влияют химический состав, консистенция пищевых продуктов и физико-химические условия внешней среды.

Для характеристики тепловыделения отдельного вида микроорганизмов может быть использована величина удельной теплопродукции клеток (F_i):

 

F_i = q_i/N_i,

 

где q_i – мощность тепловыделения клеток i-го вида;

N_i – количество клеток i-го вида.

Для устранения влияния видового состава микроорганизмов на тепловыделение образцов проводят усреднение удельной теплопродукции клеток:

 

F₀ = (F₁*N₁ + F₂*N₂ + …F_i*N_i)/N₀,

 

где F₀ – среднее значение удельной теплопродукции клеток;

N₀ – общее количество микроорганизмов в образце.

Поскольку усреднение проводится при наличии большого количества клеток, то получаются статистически хорошо воспроизводимые результаты анализа термогенеза микроорганизмов.

Влияние различий химического состава и консистенции продуктов на активность микрофлоры учитывается путем проведения процедуры градуировки. Для этого проводятся измерения теплопродукции образцов пищевых продуктов с известным содержанием микроорганизмов, определенным, например, методом посева на чашках. Возможно также устранение влияния химического состава и консистенции продуктов на активность микрофлоры путем перевода клеток микроорганизмов в универсальную питательную среду. В последнем случае это позволяет избежать влияния сезонных изменений химического состава пищевых продуктов на активность микроорганизмов.

Влияние размножения клеток на процесс измерения теплопродукции микроорганизмов учитывают, если длительность измерений сравнима с удельной константой скорости размножения клеток, и определяют в предварительных испытаниях при градуировке микрокалориметра.

ХОД РАБОТЫ.

Отобранный образец (10 см³) натурального сборного сырого молока, поступающего на молокоперерабатывающие предприятия, разделяют на 2 части по 5 см³ и помещают в стерильные пробирки. Одну часть закрывают притертой пробкой и подвергают тепловой обработке на кипящей водяной бане в течение 10 минут для подавления жизнедеятельности микроорганизмов и используют в качестве контрольной пробы. После остывания до 30^оС 1 см³ контрольной пробы заправляют в канал Б микрокалориметра, а в канал А помещают 1 см³ необработанной пробы молока. После заправки пробы термостатируют в микрокалориметре в течение 10 минут и затем проводят измерение стационарного значения теплопродукции клеток.

Параллельно с проведением биокалориметрических измерений из пробы сырого молока отбирают 1 см³ и готовят ее десятикратное разведение в физиологическом растворе. Методом глубинного посева засевают по 1 см³ 3-го и 4-го разведения в МПА. Для каждого разведения используют по 3 чашки Петри. После термостатирования чашек при 30^оС в течение 3-х суток подсчитывают среднее значение числа выросших колоний (n_oi) для каждого разведения. Для подсчета содержания микроорганизмов в молоке отбирают чашки с числом колоний в диапазоне 30-300 колоний/чашку. Общее количество мезофильных аэробных и ифакультативно анаэробных микроорганизмов в методе посева на чашках для образца молока определяют по формуле:

 

N = (0,1*n₀₁*w₁ + n₀₂*w₂)/(V*f),

 

где f – максимальная степень разведения исходного образца;

w_i – весовая доля i-го разведения в среднем;

V – объем пробы, вносимой на чашку Петри при посеве;

n_oi - среднее число колоний, выросших на чашках для i-го разведения:

 

n_oi = ,

 

где - число чашек i-го разведения с числом колоний, попадающих в требуемый интервал.

Среднее значение физиологической активности бактерий в молоке определяют по формуле:

 

Метод основан на калориметрическом измерении тепловой мощности, выделяемой в процессе жизнедеятельности микрофлоры молока, которая является энергетической характеристикой ее физиологической активности.

Аппаратура, материалы и реактивы:

- микрокалориметры типа МКМ-Ц по ТУ 25-2477.0040;

- термометры стеклянные жидкостные (не ртутные), диапазон измерения

0-100^оС, цена деления шкалы 1^оС по ГОСТ 28498;

- стерилизатор паровой медицинский по ГОСТ 19569;

- электропечь сопротивления лабораторная или шкаф сушильный, диапазон регулирования температуры от 50 до 200^оС;

- стаканчики для взвешивания (бюксы) типов СВ или СН по ГОСТ 25336;

- шприцы медицинские типа «Рекорд» вместимостью 5 и 20 см³;

- иглы инъекционные для шприцов типа «Рекорд»;

- холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678;

- пробирки типов П1 и П2 соответственно диаметром 16 мм, высотой 150 мм и диаметром 21 мм, высотой 200 мм по ГОСТ 25336;

- спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;

- вода дистиллированная по ГОСТ 6709;

- бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;

- пергамент по ГОСТ 1341.

Подготовка к измерению.

Кюветы микрокалориметра стерилизуют спиртом.

Подготовку к работе и градуирование прибора (определение физиологической активности микрофлоры молока F) проводят в соответствии с требованиями технического описания и инструкции по эксплуатации микрокалориметра, прилагаемых к прибору.

Тепловой поток микрофлоры молока проводят при температуре статирования 30 или 37^оС, которую устанавливают переключателем «Температура».

Объем (1 см³) вводимых в кюветы дистиллированной воды и молока контролируют по шкалам шприцов.

Отобранную пробу молока перед исследованием тщательно перемешивают и разделяют пополам на две пробы №1 и №2, которые помещают в стерильную посуду с пробками. Затем пробу №1 пастеризуют при температуре (90±5)^оС в течение не менее 15 минут. После окончания пастеризации эту пробу охлаждают до температуры (25±5)^оС и заправляют стерильным шприцом в одну из кювет. Пробу №2 помещают в холодильник.

Проведение измерений.

Общее количество микроорганизмов в молоке определяют по величине теплового потока 1 см³ молока (₀) с учетом значения физиологической активности его микрофлоры (F).

Заправку одной кюветы пробой №1 проводят в трехкратной повторности с целью удаления из нее остатков дистиллированной воды или спирта. Третью порцию оставляют для измерения. Вторую сравнительную кювету оставляют с дистиллированной водой. В результате получают заправленную в микрокалориметр систему: дистиллированная вода – пастеризованное молоко, для которой регистрируют отсчет показаний базовой линии для пробы №1 с остановленным процессом метаболизма микрофлоры в молоке.

После окончания регистрации показаний базовой линии проводят перезаправку кюветы с пастеризованным молоком пробой №2 молока с естественным начальным уровнем физиологической микрофлоры в молоке. Заправку молока осуществляют стерильным шприцом в трехкратной последовательной повторности с целью вымывания остатков пробы №1. Третью порцию оставляют для измерения. В итоге получают систему: дистиллированная вода – молоко, для которой регистрируют отсчет показаний теплового потока Q.

Обработка результатов.

Теловой поток, выделяемый микрофлорой 1 см³ молока Q₀, Вт/см³, вычисляют по формуле, используя измеренное значение теплового потока Q:

Q₀ = Q/ V,

где Q – значение теплового потока, выделяемого микрофлорой в пробе №1 молока, Вт;

V – объем пробы молока №2, введенный в кювету, см³.

Общее количество микроорганизмов в 1 см³ молока N_o, 1*10⁶ ед/см³, вычисляют по формуле:

N_o = 1,15* Q₀/ F,

где Q₀ – значение теплового потока, выделяемого микрофлорой 1 см³ молока, Вт/см³;

F – среднее значение физиологической активности микрофлоры молока, Вт/1*10⁶ ед;

1,15 – коэффициент, учитывающий прирост общего исходного количесвта микроорганизмов за время измерения теплового потока.

Предел допускаемой погрешности результата определения общего количества микроорганизмов биокалориметрическим методом равен ±0,2* N_o в 1*10⁶ ед/см³, с доверительной вероятностью Р=0,95.