Реакция преципитации. Определение, виды

Реакция преципитации (РП) (лат. praecipito - осаждать) - это формирование и осаж­дение комплекса растворимого молекулярно­го антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эк­вивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, пита­тельных средах и др. Широкое распростране­ние получили разновидности реакции преци­питации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.

Реакция кольцепреципитации. Реакцию про­водят в узких преципитационных пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соот­ношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Избыток антигена не влияет на результат реакции кольцепреципи­тации вследствие постепенной диффузии ре­агентов к границе жидкости. Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации ис­пользуют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципита­ции (реакция Асколи, при сибирской язве).

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Для постановки реакции расплавленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после его затверде­вания в нем вырезают лунки размером 2-3 мм. В эти лунки раздельно помешают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквива­лентных соотношениях они образуют преципи­тат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с разными антигенами и антителами сыворотки появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентич­ных — пересекаются.

Реакция радиальной иммунодиффузии. Иммунную сыворотку вносят в расплавленный ага­ровый гель и равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в кото­рые помещают антиген в различных разведе­ниях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вок­руг лунок. Диаметр кольца преципи­тации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения содержа­ния в крови иммуноглобулинов различных клас­сов, компонентов системы комплемента и др.

Иммуноэлектрофорез — сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяет­ся в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела кото­рой, диффундируя в гель, образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации.

Реакция флоккуляции (по Рамону) (лат. floccus — хлопья шерсти) - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции ток­син - антитоксин или анатоксин - антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

2. Реакция связывания комплемента (РСК): этапы реакции, методика определения рабочей дозы комплемента, подготовка гемолитической системы

Реакция связывания комплемента (РСК) за­ключается в том, что при наличии специфичности антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, то есть происходит связывание комплемента комп­лексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента: антиген, антитело и комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антите­ло (специфичности антигена и антител) происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет, реакция считается положительной. Если специфичность антигена и ан­тител не соответствуют друг другу, то комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз, реакция считается отрицательной. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности риккетсиозов, гонореи, коклюша, сифи­лиса (реакция Вассермана).

3. Реакции нейтрализации

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие мик­робов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой мик­робных антигенов антителами, т. е. их нейтра­лизацией. Реакцию нейтрализации (РН) прово­дят путем введения смеси антиген-антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем дейс­твии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело.

III. План практической работы

1. Изучить технику постановки и учесть реакцию преципитации (РП) в геле с целью определения токсигенности дифтерийной палочки (РН токсина антитоксической сывороткой).

Полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой, накладывают на поверхность прозрачного агара в чашке Петри. Культуры дифтерийной палочки сеют бляшками на расстоянии 0,6-0,8 см от полоски фильтровальной бумаги и 1-1,5 см друг от друга. Исследуемые и контрольную (токсигенную) культуры дифтерийной палочки чередуют с одной стороны полоски фильтровальной бумаги, а напротив, с другой стороны полоски сеют одноименные культуры (дубли). Чашку инкубируют при 37^◦С в течение 24-48 часов. Затем проводят учет. Положительной реакция считается при наличии тонкой линии преципитата между полоской фильтровальной бумаги и ростом бактерий в виде бляшки, отрицательной – при её отсутствии. Реакция считается специфичной, если контрольная культура дала положительный результат.

2. Поставить и учесть реакцию кольцепреципитации Асколи в диагностике сибирской язвы (с целью обнаружения антигенов возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале).

Из органов трупа животного (селезенки, участков воспаления и геморрагий кишечной стенки, легких) готовят термоэкстракт, путем кипячения в изотоническом растворе хлорида натрия и фильтрования, возможно содержащий термостабильный антиген возбудителя сибирской язвы. Реакцию ставят в узких преципитационных пробирках, внося равные объемы (0,3-0,5 мл) каждого компонента, причем второй компонент реакции осторожно наслаивают на первый, наклоняя пробирку под углом 45^◦. Реакция ставится согласно схеме (таблица).

Ингредиенты	Рабочая пробирка	Отрицательный контроль сыворотки	Положительный контроль сыворотки	Контроль термоэкстракта
Исследуемый материал (термоэкстракт из органов животного)	+			+
Диагностикум (стандартный сибиреязвенный антиген)			+
Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (на дно)	+	+	+
Нормальная сыворотка животного (на дно)				+
Изотонический раствор NaCl		+

В случае наличия антигенов возбудителя сибирской язвы втермоэкстрактена границе между жидкостями появляется мутно-белое кольцо преципитата не позднее, чем через 15 минут.