Методи визначення резус-належності

Визначення резус-належності можна проводити в крові, взятої безпосеред­ньо перед дослідженням з місця уколу пальця, консервованій крові й еритро­цитах, які випали в осад із крові, взятої без стабілізатора. Кров для досліджен­ня дозволяється зберігати протягом 3 діб при температурі + (2-6) °С.

Визначення резус-належності крові проводять у два етапи: спочатку кров донорів досліджують стандартною сироваткою анти-D (Rh_o) або моноклональними реагентами анти-D-cyпер, а потім кров, яка дала негативну реакцію з сироваткою анти-D (Rh_o), досліджують додатково із стандартними сироват­ками антирезус, що містять, крім анти-D (Rh_o), антитіла анти-С(гh') і анти-E(rh"). Антитіла анти-С(rh') і анти-Е-(гh") можуть знаходитись у сироватці крові як у чистому вигляді, так і в суміші з антитілами анти-D (Rh).

Визначення Rh-фактора, як і групи крові, здійснюють лікарі-лаборанти спеціалізованих і сертифікованих лабораторій. При визначенні резус-належ­ності крові, необхідно користуватись чинними інструкціями, наявними в роз­порядженні антирезусними сироватками, еритроцитами та моноклональними тілами. В усіх випадках попередньо проводять визначення групової належності крові. Резус-фактор є спадковим і не залежить від групи крові, статі та інших особливостей людини.

1. Методика визначення резус-належності за стандартними сироватками. Антирезусні сироватки виготовляють звичайно у вигляді універсальних, тоб­то позбавлених групових антитіл. Такі сироватки придатні для визначення резус-належності крові людей будь-якої групи за системою АВ0. Однак за певних обставин антирезусні сироватки виготовляють із крові різних груп за системою АВ0. У цих випадках, у разі визначення резус-фактора, необхідно враховувати групову специфічність сироватки. Антирезусною сироваткою групи І(0αβ) визначають резус-фактор тільки в еритроцитах групи І(0 αβ); анти­резусною сироваткою групи ІІ(Аβ) - резус-фактор тільки в еритроцитах І(0) і ІІ(Аβ); антирезусною сироваткою групи ІІІ(Вα) - резус-фактор тільки в ерит­роцитах групи І(0) і ІІІ(В); антирезусною сироваткою групи IV(AB0); і спеці­ально виготовленою універсальною визначають резус-фактор в еритроцитах групи IV(AB0) і будь-якої іншої групи крові.

Під час кожного дослідження для перевірки специфічності й активності антирезусної сироватки необхідно ставити контроль. Для контролю застосо­вують стандартні резус-позитивні еритроцити групи І(0αβ) або тієї ж групи, що і досліджувана кров, і стандартні резус-негативні еритроцити обов'язково тієї ж групи, що і досліджувана кров.

Визначення резус-фактора обов'язково слід проводити двома серіями стан­дартних антирезусних сироваток. Якщо стандартні сироватки активні в різних умовах (наприклад, одна з них містить повні антитіла і тому активна в сольо­вому середовищі, а друга містить неповні антитіла й активна в колоїдному середовищі - в желатині або поліглюкіні), то визначення резус-належності слід проводити різними методами, як вказано в супровідній інструкції для кожної серії сироваток.

Експрес-метод визначення резус-належності за допомогою сироватки антирезус IV(ABo) групи крові, розведеної 20-30 % розчином альбуміну або 30-33 % розчином поліглюкіну без підігріву. На дно чашки Петрі наносять краплю такої стандартної сироватки IV(ABo) групи крові, яка містить антирезусні ан­титіла, і поряд краплю резус-негативної сироватки IV(ABo) групи, яка не містить антитіл. До цих крапель добавляють досліджувану кров, у 2-3 рази менше за об'ємом, перемішують скляними паличками або почергово кутами предметного скла, погойдують чашкою 3-4 хв, після чого добавляють по 1 краплі ізотонічного розчину хлориду натрію. Результати читають через 5 хв. При наявності аглютинації досліджуваних еритроцитів із антирезусною сиро­ваткою і відсутності реакції з контрольною резус-негативною сироваткою -кров резус-позитивна. При відсутності реакції аглютинації в обох сироват­ках - кров резус-негативна.

Основними причинами помилок при визначенні резус-фактора за стандарт­ними сироватками можуть бути: знижена активність антирезусних сироваток, порушення пропорції досліджуваної крові та сироватки, невідповідність тем­пературного режиму, зменшення експозиції (менше 1 год), відсутність конт­рольних і специфічних проб.

2. Визначення резус-фактора за допомогою моноклональних антитіл. Моно-клональні реагенти (антитіла) призначені для виявлення окремих антигенів сис­теми резус на еритроцитах людини. Їх застосовують замість ізоімунних сирова­ток або паралельно з ними. Моноклональні тест-реагенти - це моноклональні антитіла, які виробляються гетерогібридомою. Моноклональні анти-D-антитіла випускають у вигляді повних (IgM) та неповних (IgG) антитіл. Анти-D-IgM-антитіла викликають пряму аглютинацію еритроцитів, які мають D-антиген, і можуть використовуватись у будь-якій модифікації прямої аглютинації.

Визначення резус-належності крові за допомогою моноклональних антитіл слід проводити в два етапи: спочатку кров хворого досліджують за допомо­гою реагенту моноклональних антитіл анти-D, якщо отримують негативну реакцію з цим реагентом, то додатково проводять дослідження такої крові з моноклональним стандартним реагентом анти-С. Моноклональні антитіла використовують у реакціях прямої аглютинації на площині, у пробірках та на мікроплаті. Визначення антигенів D і С можна проводити у нативній крові, взятій із консервантом; у крові, взятій без консерванта.

Реакція аглютинації на площині. На пластину або предметне скло нано­сять велику краплю (0,1 мл) реагенту антирезус, поряд наносять маленьку краплю (0,05 мл) досліджуваної крові і змішують їх. Реакція аглютинації по­чинається через 10-15 с. Чітка аглютинація настає через 30-60 с. Результат реакції оцінюють через 3 хв після змішування реагенту з кров'ю.

Реакція аглютинації в пробірках. Для цього відмивають еритроцити з досліджуваної крові і готують із них 5% суспензію у фізіологічному розчині. У пробірку вносять 1 краплю реагенту (близько 0,1 мл) і добавляють 1 краплю 5% суспензії еритроцитів. Вміст пробірки ретельно перемішують струшуван­ням та інкубують (витримують) 30 хв при кімнатній температурі. Після цього пробірку центрифугують зі швидкістю 1500-2000 об./хв протягом 1 хв. Обереж­но струшуючи пробірку, оцінюють її вміст. При негативному результаті ре­акції осад еритроцитів легко розбивається й утворює гомогенну непрозору сус­пензію. При позитивному результаті осад не розбивається, а залишається у ви­гляді одного або декількох великих згустків (аглютинатів) на фоні прозорої рідини.

Реакція аглютинації на мікроплаті. У лунку мікроплати вносять 1 краплю (0,05 мл) тест-реагенту і змішують із краплею 5% суспензії еритроцитів, відми­тих у фізіологічному розчині. Залишають на 45-60 хв для інкубації при кімнатній температурі. Результат реакції оцінюється за рисунком осаду, який утворився на дні лунки. При негативному результаті осад рівномірний, гомогенний. При позитивному результаті осад розташовується нерівномірно, краї його нерівні.

При виникненні труднощів у визначенні резус-належності крові, здійсню­ють реакцію Кумбса з використанням антиглобуледної сироватки (АГС). В про­бірку вносять антирезусну сироватку і відмиті еритроцити, поміщають на 1 го­дину в термостат при температурі 37°С, після чого еритроцити ретельно відми­вають. Потім краплю зависі еритроцитів змішують з антиглобуледною сироваткою. Наявність аглютинації свідчить про Rh⁺, відсутність такої – Rh-.

Слід відмітити, що деякі люди з резус-негативною кров'ю є носіями окре­мих специфічних Rh-антигенів. У зв'язку з чим у всіх випадках при переливанні крові слід проводити пробу на резус-сумісність. Не допускається перенесення в карту стаціонарного хворого відомостей із паспорта або інших документів про групу крові і резус-належність, в них можуть бути внесені недостовірні дані.