Методи визначення групи крові

Визначення груп крові здійснюють за системою АВО, шляхом ідентифі­кації специфічних антигенів та антитіл і ґрунтується на феномені аглютинації з використанням двох методичних підходів:

1. На еритроцитах визначають наявність антигенів А, В за допомогою:

а) стандартних сироваток із специфічними ізоаглютинінами;

б) моноклональних антитіл (МКА).

2. У сироватці визначають наявність ізоаглютинінів α та β за допомогою стандартних еритроцитів відомої групи крові.

Визначення групи крові у людей проводять лікарі-лаборанти спеціалізо­ваних і відповідно сертифікованих лабораторій із наступним записом резуль­татів у спеціальний журнал та внесенням їх у вигляді штампа в паспорті. При прийнятті хворого на стаціонарне лікування первинне визначення групи крові виконують спеціально підготовлені лікарі-лаборанти централізованих (клінічних) лабораторій. Результати визначення групи крові записують у спеці­альний журнал та на бланк із зазначенням дати та за підписом особи, яка про­водила його. Цей бланк підклеюють до карти стаціонарного хворого. Крім того, результат, який вказаний на цьому бланку, лікуючий лікар фіксує на титульній сторінці і скріплює підписом, вказавши дату.

У невідкладних випадках, коли хворому необхідна термінова трансфузія крові або її компонентів, а визначення групи крові лікарем-лаборантом не­можливо організувати, визначення групи крові проводить лікуючий лікар з обов'язковим наступним наданням пробірки з кров'ю хворого в лабораторію для остаточного визначення групової належності.

Визначення групи крові в усіх випадках обов'язково проводять за допомо­гою стандартних сироваток двох серій кожної групи або моноклональних ан­титіл. У сумнівних випадках додатково перевіряють присутність ізоаглю­тинінів, використовуючи стандартні еритроцити.

1. Визначення групи крові за допомогою стандартних сироваток. Стан­дартні сироватки виготовляються в ампулах спеціальними лабораторіями установ служби крові. Сироватки зберігають у холодильнику при темпера­турі +6-2 °С. Термін зберігання сироватки вказаний на етикетці (6 місяців від дня виготовлення). Кожна ампула сироватки повинна мати паспорт-етикетку зі зазначенням групи крові, номера серії, титру, терміну придатності, місця виготовлення. Використовувати ампули без етикеток категорично заборо­няється! Всі стандартні сироватки залежно від групи крові мають своє кольоро­ве маркування: І(0αβ) - безколірна; ІІ (Аβ) - голуба; ІІІ (Вα) - червона і IV(ABo) - жовта. Відповідне маркування сироваток є на етикетках у вигляді кольоро­вих смужок. На етикетці ампули Сироватки І(0αβ) групи смужки немає, ети­кетка сироватки ІІ(Аβ) групи має дві смужки голубого кольору, сироватки ІІІ(Вα) групи - три смужки червоного кольору і сироватки IV(ABo) групи - чотири смужки жовтого кольору. Сироватка повинна бути світлою і прозо­рою, ампула - цілою. Наявність пластівців, осаду, помутніння є ознаками не­придатності сироваток. Кожна сироватка повинна мати свій титр. Титр сиро­ватки - це те найбільше її розведення, за якого ще можлива аглютинація. Чим більший титр, тим надійніша сироватка. Для визначення групи крові бажано користуватися сироватками з титром, що не нижче 1:32. Слід пам'ятати, що при значному розведенні сироваток реакція аглютинації може не відбутися. Сироватка відповідної групи крові повинна мати свою серію і високу активність, перші ознаки аглютинації повинні з'являтися не пізніше 30 с. Серія характеризує сироватку, що виготовлена з крові певної людини.

Для визначення групи крові використовують цільну кров, відмиті еритро­цити, еритроцити в плазмі, сироватці або в 0,9 % розчині натрію хлориду. У хворих на анемію кров стабілізують гепарином.

Визначення групи крові проводять у приміщенні із задовільним освітлен­ням при температурі від +15 до +25 °С (оптимальна 18-24 °С). Його здійсню­ють на спеціальних (із заглибленнями) або звичайних порцелянових пластинах або тарілочках. Останні ділять кольоровими олівцями на чотири квадрати і в напрямку за годинниковою стрілкою позначають сектори груп крові: І(0αβ); ІІ(Аβ); ІІІ(Вα); IV(ABo). У відповідності до кожного сектора тарілки з допомо­гою піпетки наносять по одній краплі сироваток двох серій. Потім у хворого протирають ваткою, змоченою 96° спиртом, подушечку кінцевої фаланги тре­тього або четвертого пальців лівої кисті і проводять прокол спеціальною гол­кою (скарифікатором). Першу краплю крові знімають марлевою кулькою, а наступну краплю збирають у стерильний капіляр Панченкова або з допомо­гою різних кутів предметного скла і послідовно вносять до сироваток, розмі­шуючи їх. Співвідношення крові і сироватки повинно бути 1:10 (0,01 мл дослі­джуваної крові або еритроцитів і 0,1 мл кожної сироватки двох серій). Змішав­ши окремими скляними паличками або різними кута­ми предметного скельця кож­ну краплю крові (еритроцитів) 3 відповідною сироваткою, обережно беруть порцеляно­ву пластину (тарілочку) і по­гойдують. Потім залишають на 1-2 хв. у спокої і знову по­гойдують. Спостереження за ходом реакції проводять не менше як 5 хв, тому що мож­лива аглютинація, наприклад, з еритроцитами ІІ(А₂β) і IV(A₂B0) груп крові. Через 3-4 хв до крапель суміші сиро­ватки з еритроцитами, де відбулася аглютинація, до­дають по 1 краплі 0,9 % роз­чину натрію хлориду і продов­жують спостерігати до 5 хв. періодично погойдуючи пла­стину (рис. 1.5.1).

 

Рис. 1.5.1. Визначення реакції аглютинації та групи крові

за стандартними сироватками.

 

 

Реакція ізоаглютинації в кожній краплі може бути позитивною і негативною. У разі позитивної реакції в суміші з'являються видимі неозброєним оком дрібні червоні зернятка (аглютиніни), які складаються зі склеєних еритроцитів. Дрібні зернятка поступово склеюються у більші зерна, а інколи в пластівці неправильної форми, в результаті чого сироватка зовсім або частково знебар­влюється. У разі негативної реакції рідина весь час (5 хв) залишається рівно­мірно забарвленою і в ній не спостерігається зернистості (аглютинінів). Ре­зультати реакції в краплях з сироватками однієї і тієї ж групи (двох серій) мають співпадати.

Трактування результатів реакції аглютинації під час визначення груп крові представлені в таблиці 1.5.1.

 

Таблиця 1.5.1 Варіанти груп крові

 

Стандартні сироватки	1-ша крапля	2-а крапля	3-тя крапля	4-та крапля	Група крові
αβ	—	—	—	—	І(Оαβ)
β	+	—	+	—	II (Aβ)
α	+	+	—	—	III (Bα)
	+	+	+	—	IV (АВ0)

2. Визначення групи крові за допомогою моноклональних антитіл цоліклонів. Цоліклони (моноклональні антитіла) використовуються замість стан­дартних сироваток. Цоліклони проти антигенів А і В продукуються двома різними пухлинними гібридомами, які утворюються при взаємодії В-лімфоцитів мишей з клітинами мієломи мишей. Асцитична рідина, що продукується гібри­домами, містить імуноглобуліни класу М (IgM), які спрямовані проти специфіч­них груп антигенів А і В системи АВО крові людини. Визначення групи крові проводять у крові без консервантів і встабілізованій за допомогою консер­вантів (глюгіцир, цитроглюкофосфат, гепарин, натрію цитрат). Цоліклони дають швидку і виразнішу реакцію аглютинації порівняно зі стандартними сироватками. Вони випускаються у флаконах або ампулах по 20, 50, 100 і 200 доз (1 доза = 0,1 мл). Цоліклон забарвлений у червоний колір - анти-А і в синій колір - анти-В. їх зберігають у холодильнику при температурі + (2±6) °С. Термін зберігання - 2 роки. Визначення групи крові проводять при темпера­турі від 15 до 25 °С. На тарілочку наносять дві краплі цоліклону анти-А та дві краплі цоліклону анти-В на протилежному боці. Поряд з цими краплями нано­сять краплю досліджуваної крові (0,01 мл) в 10 разів меншу від цоліклону (1:10) і змішують окремими паличками або різними кутами предметного скла. Реак­ція аглютинації виникає в перші 3-5 с і проявляється дрібними червоними кру­пинками, а пізніше пластівцями. Спостереження слід вести протягом 2,5 хв. Можливі такі варіанти реакції аглютинації:

1) аглютинація відсутня з цоліклонами анти-А і анти-В, кров не містить аглютиногенів А і В, така кров належить до І(0αβ) групи;

2) аглютинація спостерігається з цоліклонами анти-А, еритроцити містять аглютиноген А - кров ІІ(Аβ) групи;

3) аглютинація на­стає з цоліклоном анти-В - кров ІІІ(Ва) групи;

4) аглютинація спостерігається з цоліклонами анти-А і анти-В, еритроцити містять аглютиногени А і В - кров IV(AB) групи. Враховуючи високу активність цоліклонів, при наявності реа­генту анти-АВ, визначення групи крові можна проводити тільки з однією се­рією MICA анти-А і анти-В.

У випадку позитивної реакції аглютинації з обома цоліклонами анти-А і анти-В, тобто встановлення групи крові IV(ABo), необхідно провести додат­кове контрольне дослідження даного зразка крові з 0,9 % розчином натрію хло­риду. Для цього змішують одну велику краплю (0,1 мл) 0,9 % розчину натрію хлориду з маленькою (0,0Імл) краплею досліджуваної крові. Відсутність аг­лютинації в досліджуваній крові свідчить, що кров належить до IV(ABo).

3. Визначення групи крові за стандартними еритроцитами. Із вени хво­рого беруть 4 мл крові в пробірку і центрифугують. На тарілочку, розділену на сектори, наносять відповідно до підписів по краплі сироватки. До них до­бавляють 10-20% суспензію стандартних еритроцитів І(0), ІІ(А) і ІІІ(В) у співвідношенні 1:5, тарілочку похитують протягом 3 хв, потім добавляють по краплі ізотонічного розчину хлориду натрію, результат оцінюють через 5 хв. Можливі 4 варіанти реакцій аглютинації:

1) аглютинація відсутня з еритроци­тами І(0) і визначається з еритроцитами П(А) і Ш(В) - група крові І(0αβ);

2) аглютинація негативна з еритроцитами 1(0) і ІІ(А) груп і позитивна з еритроцитами Ш(В) - група крові ІІ(αβ);

3) аглютинація відсутня з еритроцитами І(0) і Ш(В) груп та позитивна з еритроцитами П(А) групи - група крові ІІІ(Ва);

4) аглютинація негативна з еритроцитами 1(0), ІІ(А) і Ш(В) групи - досліджу­вана кров IV(ABo) групи (табл. 1.5.2).

У випадку розбіжності результатів визначення групи крові у донорів за допомогою цоліклонів і стандартних еритроцитів використання такої крові для переливання хворим не дозволяється, і кров направляють для детального дослідження до спеціалізованої лабораторії. Якщо результати двох тестів не відповідають крові реципієнта, якому необхідне термінове переливання крові,

 

Таблиця 1.5.2 Варіанти груп крові за цоліклонами і стандартними еритроцитами

 

 

 

№ п/п	Реакція досліджуваних еритроцитів з МКА (цоліклонами)	Реакція досліджуваної сироватки (плазми) із стандартними еритроцитами групи	Досліджувана кров належить до групи
Анти-А	Анти - В	І(0)	ІІ (А)	ПІ (В)
	—	—	—	+	+	І (0αβ)
	+	—	—	—	+	II (Aβ)
	—	+	—	+	—	III (Bα)
	+	+	—	—	—	IV (АВ0)

 

то в цьому випадку йому можна перелити резус-сумісну еритроцитарну масу групиІ(0оф) або резус-негативну еритроцитарну масу групи крові І(0 αβ). Слідвідмітити, що група крові людини, як і всі інші ознаки, успадковується цісласичними законами генетики і визначається набором генів, які вона одержала з материнською або батьківською хромосомою. Якщо ми знаємо групи кровіобох батьків, то неважко передбачити, яку групу крові можуть мати діти.

 

Помилки при визначенні групової належності крові:

1. Технічні помилки:

а) помилкове розташування стандартних сироваток, еритроцитів або цоліклонів;

б) невідповідність об'ємних співвідношень сиро­ваток, еритроцитів або цоліклонів і досліджуваної крові;

в) передчасне заключення(до 5 хв) про результат проби (при сповільненій аглютинації);

г) непра­вильний запис досліджуваної крові;

д) неспецифічна реакція - аглютинація, що виникає зі свіжою кров'ю при температурі вище +25 °С;

е) неспецифічна реакція холодових антитіл панаглютинація, для її уточнення планшет або та­рілочку поміщають у термостат при температурі 37 °С на 5 хв, після чого несправжня аглютинація зникає, а справжня залишається;

е) невикористання контрольної реакції з сироваткою групи крові IV(ABo) або ізотонічним розчи­ном натрію хлориду при роботі з цоліклонами;

ж) забруднення або викорис­тання мокрих піпеток, пластинок, паличок.

2. Помилки, пов 'язані з неповноцінністю стандартних сироваток, еритро­цитів, цоліклонів або досліджуваної крові:

а) слабкі стандартні сироватки з тит­ром нижче 1:32 або із закінченим терміном зберігання, або слабкі форми антиге­ну А (частіше) чи В (рідше);

б) недостатньо законсервовані або заготовлені з порушенням асептики сироватки, еритроцити, цоліклони;

в) неспецифічна аг­лютинація еритроцитів досліджуваної крові "монетні стовпчики", феномен Томсена, який пов'язаний із бактеріальним забрудненням крові або тривалим її знаходженням при кімнатній температурі).

Для попередження помилок, пов'яза­них з псевдоаглютинацією необхідно користуватися пробою з фізіологічним розчином. Для цього до крапель досліджуваної крові, де настала аглютинація, але не раніше ніж через 3 хв, додають краплю фізіологічного розчину, змішують і, похитуючи тарілочкою, спостерігають протягом 5 хв. Додавання фізіологіч­ного розчину посилює справжню аглютинацію і усуває хибну.

3. Помилки, пов'язані з біологічними властивостями крові:

а) низький титр аглютиногенів досліджуваної крові при визначенні групи крові за стандартни­ми сироватками або аглютинінів за стандартними еритроцитами;

б) наявність у групах крові ІІ(Аβ) і IV(ABo) слабких аглютиногенів А₂; А₂В, з якими спос­терігається слабка та пізня аглютинація. При цьому можуть виникати помил­ки, при яких кров групи IV(A₂Bo) визначається як кров групи III (Bα), а кров ІІ(А₂β) - як групи І(О αβ).

В усіх випадках нечіткого або сумнівного результату необхідно повтори­ти визначення групи крові за допомогою інших серій сироваток, цоліклонів або "перехресним способом", за допомогою стандартних еритроцитів.