Генерация мирнк galectin нокдаун клонов

Малых интерферирующих РНК (киРНК) использовали для ген-специфического РНК - интерференции, чтобы блокировать экспрессию человеческого галектина-1 и галектина-3. Короткие шпильки РНК (shRNAs), которые генерируют миРНК внутриклеточно были выражены с помощью МИССИЯ shRNA клонов (GenBank TM присоединение и NM_002306.1-536s1c1) в пределах лентивирусов вектора pLKO.1-Пуро, который содержит как бактериальный (ампициллин) и млекопитающих (генов пуромицин) Сопротивление (Sigma). Плазмидные векторы shRNA получали из бактериальных запасов глицерина (Sigma) после бактериальной культуры амплификации в LB бульоне (Sigma), содержащей 100 мкг / мл ампициллина и EndoFree очистки плазмидной комплект макси в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen, Valencia, CA). Трансфекции клеток проводили, как опубликовано (9). Стабильное ген глушителей был приобретен путем селекции трансфицированных иммортализованных эпителиальных клеток (end1 / E6E7) с 10 мкг / мл пуромицин (Sigma). Нецелевых вектор управления МИССИЯ shRNA (Sigma) был использован для генерации контроля клеточной линии END1 / E6E7. Векторного управления shRNA последовательность содержит 5 пар оснований несоответствия каким - либо известным геном человека и мыши и активирует RISC и RNAi путь, но не цель любой ген человека или мыши. Экспрессия гена глушителей подтверждали Вестерн - блоттинга и ELISA (R & D Systems).

Количественное иммунных медиаторов

Уровни белка галектина-1, галектин-3, IL-8, RANTES и MIP-3α одновременно количественно, используя специально разработанный мультиплекс электрохемилюминесценции (ECL) иммунологический, Sector Imager 2400 и Discovery Workbench Software (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD), сверяются с традиционным методом ELISA (9, 37, 38). Галектин-1 и -3 уровней были также оценены с помощью традиционного коммерчески доступного ELISA (R & D Systems). Концентрации растворимых внеклеточных медиаторы,высвобождаемые в надосадочной жидкости культуры клеток измеряли в пикограмм / мл. Уровни Галектин в клеточных лизатов (клеточные переплете galectins) измеряли также в пикограмм / мл с помощью ELISA, а затем нормированы к общему белку лизата клеток, таким образом, количественной оценки galectins в нанограммов / мг общего белка. Общее содержание белка определяли с помощью анализа белка Pierce BCA. ELISA и BCA анализы были прочитаны с помощью ридера Victor2 (PerkinElmer Life Sciences).

Жизнеспособность клеток Анализы

Эпителиальный жизнеспособность клеток в присутствии LPG, CPI-GC и рекомбинантные galectins было установлено путем нерадиоактивного анализа CellTiter96 МТТ, преобразующий MTT красителя в синий формазана (Fisher).Жизнеспособность T. влагалищной -infected клетки оценивали микроскопически и с помощью трипанового синего анализа (Fisher), так как трихомонады может преобразовать MTT красителя и препятствует МТТ - анализе.

Статистика

Данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа (GraphPad Prism, версия 5.0; GraphPad Software). Р значения <0,05 считались значимыми.

STI

инфекций, передаваемых половым

CPI-CG

керамиды фосфоинозитол Гликан ядро

LPG

lipophosphoglycan

RANTES

Регулируемая по активации Т-клеток нормальной экспрессии и секреции

PolyLacNAc

поли N - ацетил-лактозамином

МТТ

3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид

ANOVA

Дисперсионный анализ

м

мутант

Относительной влажности

рекомбинантный человеческий

LEA

Л. Esculentum агглютининов.

В заключение, данное исследование дает экспериментальное доказательство того, что T.влагалищной паразит использует его LPG / CPI-GC связывания с галектина-1 и галектина-3 ниспровергать иммунного ответа, связанные с клиренсом инфекции в шеечно среде, как схематически представлены в рис. 9. В соответствии с предложенной парадигмы заболевания, T.влагалищной через высокое сродство его связывания с СНГ галектина-1 использует для своей собственной выгоды иммунный ответ естественный хозяин, что эпителий выдвигает ограничить воспалительное повреждение через галектин-1 сигнализации. В то же время, разрушающих уровни галектина-3, Т.влагалищной уменьшает распознавание LPG через этот галектина, который опосредует нормальное разрешение инфекции через хемокинным-опосредованной нейтрофилов и макрофагов набора. В результате двойного взаимодействия с галектина-1 и -3 является подавленным слизистых оболочек окружающей среды, менее враждебны к паразиту, который в соответствии с клиническими результатами упорного и часто молчаливого / бессимптомный характер этой инфекции. Разнообразие CPI-GC связывания с галектина-3 следует дополнительно изучить в качестве предполагаемой молекулярной основы для симптоматики неравенства в T.влагалищной инфекции. Повсеместно сохраняется привязка к галектина-1 через T.влагалищной, если подтверждено для большего количества клинических изолятов, может возникнуть в качестве эволюционного инструмента протозойных паразитов, чтобы уйти от хозяина иммунитет, подавляя защитные иммунные реакции и должны быть дополнительно изучены наряду с галектина-3 в качестве цели будущих терапевтических подходов.

A трихомонады Ромбовидная протеаз и ее субстрат Модулируйте Паразит Привязанность и цитолиза клеток-хозяев

· Angelica М. Riestra,

· Шив Ганди,

· Майкл Дж Sweredoski,

· Энни Moradian,

· Sonja Гесс,

· Синиша Urban,

· Patricia J. Johnson