Особенности приготовления замороженных срезов

Обычная гистологическая заливка длится около 7 суток, но в некоторых случаях требуется быстрая, немедленная диагностика препарата (cito!). В таких случаях используется метод заморозки. Изъятую, но нефиксированную ткань замораживают в специальных камерах – криостатах. С помощью воды формируется ледяной блок (аналог парафинового). В криостатную камеру вмонтирован микротом, с помощью которого изготавливают замороженные срезы. При комнатной температуре они оттаивают и пригодны для немедленной гистологической окраски. Такой метод позволяет оценить структуру препарата в течение нескольких минут – до получаса. Однако метод имеет существенный недостаток: в процессе замораживания в ткани образуются кристаллы льда, нарушающие прижизненную структуру (искажение структуры или изображения носит название – артефакт).

Особенности приготовления материала для электронномикроскопического исследования

Особенности обусловлены субмикроскопическим и молекулярным уровнем исследования. Обычные фиксаторы вызывают грубую коагуляцию белков, что на электронномикроскопическом (ЭМ) уровне вызвало бы появление артефактов. Поэтому в ЭМ используют фиксаторы глютаральдегид или четырехокись осмия – вызывающие тонкую, нежную коагуляцию белков. В качестве уплотняющих сред используют эпоксидные смолы. Приготовление ультратонких срезов (нм) производят на специальных приборах ультрамикротомах с помощью стеклянных или алмазных ножей.

Гистологические красители

Существует несколько классификаций красителей. По происхождению красители бывают растительными, животными, минеральными. По химическим свойствам – кислыми, основными, нейтральными. Наибольшее прикладное значение имеет классификация красителей по назначению. В соответствии с этой классификацией все красители подразделяются на две группы:

I Прижизненные (см. выше)

- трипановый синий

- янус зеленый

- метиленовый синий

- конго красный

II Посмертные

Посмертные красители делятся на 2 вида: 1. Общие

2. Специальные

1. Общиекрасители в свою очередь делят на а) ядерные (основные),

б) цитоплазматические (кислые)

Общие ядерные красители красят ядра любых клеток в свой основной цвет. Например: 1. Гематоксилин – окрашивает ядра в фиолетово-чернильный цвет.

2. Азур – красит ядра в синий цвет.

3. Сафранин – окрашивает ядра в красный цвет.

Поскольку химическая природа ядра кислая (ДНК, РНК), ядерный краситель имеет свойства основания. В связи с этим, способность какой-либо структуры окрашиваться основными красителями называется базофилия (basis – основание, philia - любовь), а сама структура – базофильной. Высокая концентрация РНК в цитоплазме может обусловить ее базофилию.

Общие цитоплазматические красители красят цитоплазму любых клеток в свой основной цвет.

1. Эозин – красит цитоплазму в оранжево-розовый цвет.

2. Водная синька – в голубой цвет

3. Фуксин кислый – интенсивно-розовый цвет

Большинство цитоплазматических красителей являются кислыми, так как гиалоплазма дифференцированных клеток насыщена основными белками. Свойство какой-либо структуры окрашиваться кислыми красителями называется ацидофилия или оксифилия (acidicum – кислота, philia - любовь), а сама структура – ацидофильной.

 

2. Специальные красители связываются избирательно с определенной клеточной или внеклеточной структурой, позволяя отличить ее или выделить от сходных по строению структур. Чаще всего специальные красители применяют в тех случаях, когда исследуемое образование общими красителями не окрашивается. Например, включения жира и включения слизи при общей окраске остаются бесцветными. Использование специального красителя муцикармина позволяет окрасить слизь в красный цвет, а осмиевая кислота окрасит жир в черный. Другие примеры:

Судан III – жир – оранжево-красный цвет

Пикриновая кислота – мышечная ткань – желтый цвет

Кармин Беста – гликоген – красный цвет

Резорцин – фуксин - эластические волокна – сине-фиолетовый цвет

Орсеин – эластические волокна – красно-бурый цвет