Специальные методы обработки тканей.

 

1. Декальцинация. Применяется по отношению к плотным тканям (кость, зуб). Цель – извлечение солей извести. Вследствие этого объект становится мягким и пригодным к резке. Декальцинация всегда производится после фиксации. Объект помещают в 2-10% раствор азотной кислоты на несколько дней.

2. Импрегнация. Метод отложения солей тяжелых металлов на каких-либо структурах с целью их выявления. Применяют соли серебра, золота. Этот метод применяется для выявления нервных волокон, аргирофильных волокон (ретикулярных, преколлагеновых), клеточных границ, комплекса Гольджи.

3. Гистохимические методы исследования проводят с целью выявления содержания и локализации химических веществ, входящих в состав тканей, постановкой химической реакции непосредственно на срезе ткани. В результате реакции взаимодействия искомых групп или элементов исследуемого вещества с реактивом получается специфическое окрашивание. Пользуясь специальными реактивами, можно выявить аминокислотный состав белков, выявить наличие нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), определить наличие микроэлементов, ферментов и т. д.

Например: для выявления трехвалентного железа ткань обрабатывают свежеприготовленной равной смесью 2% ферроцианида калия (желтая кровяная соль) и 2% соляной кислотой.

Участки, в которых локализуется трехвалентное железо, окрашиваются в синий цвет (берлинская лазурь).

Гликозаминогликаны (ГАГ) дают реакцию метахромазии – изменение основного цвета красителя при взаимодействии его с искомым веществом. При окрашивании толуидиновой синью, тионином (красители синего цвета) ГАГ дают вишнево-красную окраску. ДНК выявляется реакцией Фельгена, РНК – реакцией Браше, углеводные соединения – ШИК-реакцией и т.д.

Цитохимия - сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии – позволяет изучать локализацию химических веществ на субклеточном и молекулярном уровнях.

4. Иммуноцитохимический(иммунофлюоресцентный) метод – основан на реакции антиген-антитело. Каждая клетка организма имеет специфический антигенный состав. Антитела обладают высокой специфичностью в отношении антигенов, что позволяет использовать их для выявления специфических белков. Антитела окрашивают флюоресцирующими красителями и после свзывания их с определенной структурой, препарат изучают в люминесцентном микроскопе.

Антитела можно использовать для изучения антигенных структур на ультрамикроскопическом уровне. Для этого антитела метят электронно-плотными частицами, например коллоидным золотом.

Авторадиография.

Меченые атомы широко используются в цитологии для изучения химических процессов в клетке. Например: для изучения биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, проницаемости оболочки, локализации веществ в клетке и т. д.

Для этого используются соединения, в которые введена радиоактивная метка. В молекуле меченого вещества, например, аминокислоты или углевода, один из атомов замещается атомом того же вещества, но радиоактивного, т. е. радиоактивным изотопом. Благодаря тому, что эти атомы ведут себя в организме также, как и не обладающие радиоактивностью, но при этом испускают радиоактивные лучи, их можно легко обнаружить, применяя фотографический метод.

В цитологии используются изотопы водорода – тритий 3Н, изотоп углерода – 14С, фосфора 32Р, серы 35S, йода и др., которые входят в состав органических соединений. Вводят изотопы в организм животных с пищей, в виде инъекций или же в питательную среду при культивировании тканей. Они включаются в обмен веществ. Доза устанавливается опытным путем и не должна изменять нормальный обмен веществ. Через разные промежутки времени после введения меченых веществ фиксируются кусочки тканей и органов (смесь Кариуа или спирт-уксусная кислота 3:1). Из фиксированного материала готовят парафиновые срезы, на поверхность которых после удаления парафина наносят тонкий слой чувствительной и фотографической эмульсии. Эта ядерная эмульсия характеризуется очень мелким размером зерен, их однородностью и гораздо большим насыщением желатина, чем обычная фотографическая эмульсия.

Препараты с нанесенной на них фотоэмульсией экспонируется в темноте при температуре 4 градуса, а потом промываются и закрепляются также, как и обычные фотографии.

Во время экспозиции препаратов изучение радиоактивных изотопов, которые включились в те или иные структуры клетки, оставляет след от пробега радиоакт. частиц в слое фотоэмульсии. В процессе проявления зерна, которые оказались в местах пробега радиоакт. частиц, восстанавливаются проявителем до металлического серебра. Последние имеют черный цвет и выявляются после проявления в виде зерен, которые находятся в слое фотоэмульсии над теми клетками и структурами, в которые включился радиоактивный изотоп. Такие препараты называют радиоактографами. После проявления и закрепления радиоактографы хорошо промывают в воде, а затем окрашивают одним из гистологических красителей.

 

 

Контрольные вопросы

1. Методы исследования, используемые в современной гистологии, цитологии и эмбриологии.
2. Витальные методы исследования. Культивирование in vivo и in vitro.
3. Основные принципы приготовления препаратов для световой микроскопии.
4. Этапы приготовления постоянного гистологического препарата.
5. Виды микропрепаратов.
6. Общая характеристика и классификация гистологических красителей.
7. Гистохимические методы исследования.
8. Сущность метода импрегнации, декальцинирования, авторадиографии.

 

Вопросы, вынесенные на СРС

1. Основные принципы приготовления препаратов для электронной микроскопии.
2. Количественные методы исследования.
3. Понятие об иммунофлюоресцентном, цитоспектрофотометрическом,

ауторадиографическом методах и их использование.

 

Основная литература

1. Луцик О.Д., Іванова А.Й., Кабак К.С. Гістологія людини. Львів. Мир. 1992. С.5-11..
2. Гистология / Под ред. Ю.И.Афанасьева, Н.А.Юриной. М.: Медицина, 2001. С.16-23.
3. Гистология / Под ред. Ю.И.Афанасьева, Н.А.Юриной. М.: Медицина, 1989.С. 9-14.

Дополнительная литература

1. Лабораторные занятия по курсу гистологии, цитологии и эмбриологии / Под. Ред. Ю.И.Афанасьева. М.: Высшая школа. 1990. С. 15-22.
2. Напханюк В.К., Сервецкий К.Л. Практикум по цитологии, общей гистологии и эмбриологии. Учебное пособие. Одесса, 1999. С. 16-23.
3. Практикум по гистологии, цитологии и эмбриологии / Под. Ред. Н.А.Юриной, А.И.Радостиной. М.: Изд-во УДН. 1989. С. 5-11.
4. Методические рекомендации кафедры.
5. Напханюк В.К. Основы цитологии, общей гистологии и эмбриологии (курс лекций).Одесса.1999. С.14-18

 

Тестовые задания М1 см1 т2

1. Исследуется влияние лекарственного препарата на клеточную подвижность. Какой из перечисленных методов позволяет наблюдать перемещение клеток?

А. Импрегнация

В. Декальцинация

С. Культивирование

D. Авторадиография

Е. Цитофотометрия

 

2. Врожденные нарушения обмена веществ характеризуются накоплением определенных соединений в тканях больного. В частности, при синдроме Марфана отмечается накопление в соединительной ткани гликозаминогликанов. Какой из перечисленных методов позволит определить количество вещества на срезе ткани?

А. Импрегнация

В. Декальцинация

С. Культивирование

D. Авторадиография

Е. Цитофотоспектрометрия

 

3. В диагностической лаборатории при изучении пунктата красного костного мозга обнаружены клетки эритроидного ряда с резко выраженной базофилией цитоплазмы. Чем может быть обусловлено это явление?

А. Концентрацией белка

В. Наличием комлекса Гольджи

С. Наличием липидных включений

D. Высоким уровнем гликозаминогликанов

Е. Высоким уровнем РНК

 

4. Для изучения реагирования изолированных живых клеток на воздействие разрабатываемого лекарственного препарата используется метод культивирования «in vitro». Какое из перечисленных условий не требует строгого соблюдения?

А. Температурный режим

В. Стерильность

С. Режим освещения

D. Питательная среда

Е. Периодические пасажи

 

4. Многие заболевания, связанные с нарушением обмена веществ, сопровождаются избыточным накоплением определенных соединений в тканях организма. Какой метод выявляет наличие и топографию данного химического соединения на клеточном и тканевом уровнях?

А. Морфометрический

В. Авторадиографический

С. Гистохимический

D. Декальцинация

Е. Импрегнация

 

5. Для синдрома Марфана характерно нарушение обмена гликозаминогликанов соединительной ткани, приводящее к их накоплению в организме. Какой гистологический метод позволит выявить эти соединения на срезе ткани?

А. Импрегнация серебром

В. Реакция метахромазии

С. Реакция Фельгена

D. Окраска резорцин-фуксином

Е. Окраска по Шморлю

 

6. Для диагностики хромосомных заболеваний исследуется кариотип человека в метафазе митоза, когда наиболее четко видна структура хромосом. Какой краситель следует применить для выяления хромосомного материала?

А. Осмиевая кислота

В. Пикриновая кислота

С. Железный гематоксилин

D. Кислый фуксин

Е. Кармин Беста

 

7. Для подтверждения клинического диагноза злокачественной опухоли у больного во время операции был взят материал для гистологической экспресс-диагностики. Какой материал в данном случае используется в качестве уплотняющей среды?

А. Парафин

В. Целлоидин

С. Эпоксидная смола

D. Лед

Е. Канадский бальзам

 

8. Для подтверждения клинического диагноза злокачественной опухоли у больного во время операции был взят материал для гистологической экспресс-диагностики. Какой прибор используется для приготовления срезов в этом случае?

А. Ротационный микротом

В. Санный микротом

С. Ультрамикротом

D. Криостат

Е. Вибротом

 

9. Одним из критериев оценки морфофункционального состояния нервной клетки служит состояние «хроматофильной субстанции», представляющей собой на электронно-микроскопическом уровне гранулярную ЭПС. Какой краситель позволит выявить эти структуры на светооптическом уровне?

А. Основной

В. Кислый

С. Нейтральный

D. Прижизненный

Е. Специальный

 

10. Метод тканевой или органной культуры часто используют для исследования механизмов эмбриональной дифференцировки и морфогенеза. При этом для повышения интенсивности пролиферативных процессов питательная среда должна содержать:

А. Нуклеиновые кислоты

В. Аминокислоты

С. Глюкозу

D. Эмбриональный экстракт

Е. Плазму крови

 

11. В эксперименте гистологическими методами изучались процессы синтеза стероидных (жировой природы) гормонов надпочечниками. Какой краситель нужно использовать для выявления жировых включений?

А. Пикриновую кислоту

В. Осмиевую кислоту

С. Муцикармин

D. Орсеин

Е. Резорцин-фуксин

 

12. В эксперименте на животном изучалось состояние эластического каркаса аорты под влиянием различных химических и физических факторов. Какой краситель позволит выявить эластические волокна в гистологическом препарате?

А. Пикриновая кислота

В. Осмиевая кислота

С. Муцикармин

D. Сафранин

Е. Резорцин-фуксин

 

13. Во время приготовления постоянного гистологического препарата перед окрашиванием производят депарафинирование срезов. Какое химическое вещество обычно используется для этой цели?

А. Этиловый спирт

В. Ксилол

С. Уксусная кислота

D. Фенол

Е. Глютаральдегид

 

14. В клинических лабораториях для установления или подтверждения диагноза используется гистологическое исследование. Какой из ниже перечисленных объектов не является препаратом?

А. Срезы

В. Мазки

С. Пленки

D. Отпечатки

Е. Взвеси

 

15. В клинических лабораториях для установления или подтверждения диагноза используется исследование гистологических препаратов, приготовленных из фиксированных тканей. Что не относится к фиксирующим жидкостям?

А. Формалин

В. Целлоидин

С. Спирты

D. Глютаральдегид

Е. Тетраоксид осмия

 

16. В экспериментальной медицине широкое применение находят прижизненные методы исследования клеток и тканей. Для усиления контрастности исследуемых образцов используются прижизненные красители. К таковым относится:

А. Янус зеленый

В. Азур

С. Эозин

D. Фуксин кислый

Е. Фуксин основной

 

17. В экспериментальной медицине широкое применение находят прижизненные методы исследования клеток и тканей. Для усиления контрастности исследуемых образцов используются прижизненные красители, которые должны отвечать главному требованию:

А. Быть бактерицидными

В. Быть нетоксичными

С. Быстро проникать в ткань

D. Избирательно связываться

Е. Коагулировать белки

 

18. В судебной и спортивной медицине для установления пола используется метод определения телец Бара, представляющие собой конденсированную Х-хромосому, занимающую маргинальное положение в ядре, либо вынесенную из ядра в виде так называемой «барабанной палочки». Каким свойством должен обладать краситель, выявляющий эти структуры?

А. Быть кислым

В. Быть основным

С. Быть нейтральным

D. Быть спиртовым

Е. Быть водным

 

19. Для правильного выбора тактики операции по поводу опухоли, гистологический анализ новообразования проводится немедленно (cito!). При этом используется метод быстрой заморозки ткани, которому свойственны артефакты. Что является наиболее мощным фактором, способствующим появлению артефактов, т.е. искажений прижизненной структуры?

А. Отсутствие химической фиксации

В. Отсутствие заливки в парафин

С. Образование кристаллов льда при заморозке

D. Деформация при приготовлении срезов

Е. Деформация при оттаивании срезов

 

20. В эксперименте изучалась секреторная активность слизистых клеток под воздействием физических и химических факторов. Какой краситель позволит выявить эти клетки на гистологическом препарате?

А. Кармин Беста

В. Муцикармин

С. Конго красный

D. Янус зеленый

Е. Толуидиновый синий

 

21. Гликогенозы – группа врожденных заболеваний, развивающихся при недостаточности ряда ферментов, в результате чего в тканях происходит накопление гликогена. Какой краситель позволит обнаружить его включения в цитоплазме клеток?

А. Кармин Беста

В. Муцикармин

С. Конго красный

D. Янус зеленый

Е. Толуидиновый синий

 

22. В эксперименте изучалась секреторная активность бокаловидных клеток под воздействием физических и химических факторов. Как выглядит цитоплазма этих клеток при окраске общими красителями?

А. Базофильной

В. Эозинофильной

С. Нейтрофильной

D. Зернистой

Е. Бесцветной

 

23. В эксперименте на животном изучалось состояние эластического каркаса аорты под влиянием различных химических и физических факторов. Как будут выглядеть эластические волокна на гистологическом препарате при окраске общими красителями?

А. Базофильными

В. Эозинофильными

С. Нейтрофильными

D. Неокрашенными

Е. Желтоватыми

 

24. При изучении мышечной ткани на препарате, окрашенном общими красителями гематоксилином и эозином, мышечная, и окружающая ее соединительная, и декальцинированная костная ткани окрашиваются в розовый цвет. Какой краситель следует предпочесть, чтобы избирательно окрасить мышечную ткань в иной цвет?

А. Пикриновую кислоту

В. Осмиевую кислоту

С. Резорцин-фуксин

D. Янус зеленый

Е. Толуидиновый синий

 

25. Частым критерием для определения состояния энергетического обмена в клетке – ткани – органе служит оценка состояния митохондрий. Какой краситель избирательно связывается с этими органеллами, делая их доступными для изучения на светооптическом уровне?

А. Пикриновую кислоту

В. Орсеин

С. Конго красный

D. Янус зеленый

Е. Трипановый синий

 

26. Для некоторых заболеваний щитовидной железы характерным является нарушение обмена йода. Какой метод должен выбрать исследователь, чтобы проследить этапы поглощения йода из крови, включения его в синтез гормонов, дальнейшее накопление и выведение в составе гормонов в кровь?

А. Морфометрический

В. Авторадиографический

С. Гистохимический

D. Декальцинацию

Е. Импрегнацию

 

27. Импрегнация – распространенный метод классической гистологии, основанный на осаждении солей тяжелых металлов на определенных структурах. Какие структуры из перечисленных ниже не выявит данный метод?

А. Клеточные границы

В. Комплекс Гольджи

С. Нейрофибриллы

D. Включения гликогена

Е. Ретикулярные волокна

 

28. Кость является высоко минерализованной тканью, не подлежащей резке на микротоме? Какой метод позволит изучение этой ткани на гистологическом препарате?

А. Морфометрический

В. Авторадиографический

С. Гистохимический

D. Декальцинация

Е. Импрегнация

 

29. Для изучения фагоцитарной активности макрофагов в живой организм вводят частички красителя, активно захватываемые макрофагами и таким образом маркируя их, что позволяет в последующем на препарате идентифицировать эти клетки. Как называется этот метод?

А. Витальное окрашивание

В. Суправитальное окрашивание

С. Специальное окрашивание

D. Иммуноцитохимия

Е. Флюорохромное окрашивание

 

30. Один из методов, позволяющих изучение закономерностей развития зародыша, заключается в том, что оплодотворенную яйцеклетку трансплантируют в жидкость передней камеры глаза опытного животного и, используя прозрачность роговицы, наблюдают ранние стадии эмбриогенеза. Как называется этот метод?

А. Клонирование

В. Гибридизация

С. Гибридизация in situ

D. Культивирование in vivo

Е. Культивирование in vitro

 

31. Больного с диагнозом макроцитарной анемии в мазке периферической крови выявлены эритроциты большого размера. Какой гистологический метод позволяет измерить диаметр эритроцитов в мазке крови?

А. Авторадиграфия

В. Цитофотометрия

С. Цитоспектрометрия

D. Морфометрия

Е. Флоуцитометрия

 

32. Для изучения механизмов обызвествления костного матрикса экспериментальному животному ввели раствор радиоактивного фосфора ³²Р. Через определенное время из кости, взятой у животного, изготовили гистологические срезы. Какой гистологический метод позволит определить включение ³²Р в костную ткань?

А. Реакция метахромазии

В. ШИК-реакция

С. Авторадиграфия

D. Гистохимия

Е. Декальцинация

 

33. Для изучения нуклеиновых кислот на срезе печени исследователь применил гистохимический метод, позволивший одновременно выявить РНК в виде красного прокрашивания цитоплазмы, и ДНК – в виде зеленого окрашивания ядра. Какой краситель был использован?

А. Толуидиновый синий

В. Гематоксилин

С. Акридиновый оранжевый

D. Конго красный

Е. Янус зеленый

 

34. В результате дефицита цианкобаламина и фолиевой кислоты у больного развилась пернициозная мегалобластная анемия, характеризующаяся нарушением синтеза ДНК в эритроидных клетках. Какой гистохимический метод предпочтительнее применить для избирательного выявления ДНК?

А. Реакция метахромазии

В. ШИК-реакция

С. Реакция Фельгена

D. Реакция Браше

Е. Реакция Эйнарсона

 

35. В эксперименте была подавлена активность фермента РНК-полимеразы, ответственного за транскрипцию мРНК в ядре. Соответственно в цитоплазме также уменьшается количество рРНК и тРНК. Какой гистохимический метод позволяет выявить наличие РНК в цитоплазме?

А. Реакция метахромазии

В. ШИК-реакция

С. Реакция Фельгена

D. Реакция Браше

Е. Реакция Эр лиха

 

36. Болезнь Гиршпрунга характеризуется нарушением нервно-мышечной передачи, обусловленной отсутствием фермента ацетилхолин-эстеразы. Какой метод применим для определения ферментов на срезах ткани?

А. Авторадиография

В. Гистохимия

С. Импрегнация

D. Культивирование

Е. Гибридизация

 

37. Болезнь Гиршпрунга, врожденная аномалия развития толстого отдела кишечника, характеризуется нарушением нервно-мышечной передачи, обусловленной отсутствием фермента ацетилхолин-эстеразы. При подготовке материала для определения ферментов на срезах ткани выполняются все процедуры, кроме:

А. Изготовление замороженных срезов

В. Отсутствие фиксации

С. Заливка в парафин

D. Заморозка

Е. Отсутствие обезвоживания

 

38. Для многих научных исследований используются стволовые клетки крови (СКК), взятые из пуповинной крови. Однако, плюрипотентная СКК морфологически напоминает малый лимфоцит и может быть идентифицирована только по набору антигенов на клеточной поверхности. Как называется такой метод?

А. Авторадиографический

В. Гистохимический

С. Цитоспектрометрический

D. Иммуноцитохимический

Е. Морфометрический

 

39. Подготовка тканей или органов, взятых для гистологического исследования, требует фиксации материала, то есть сохранении его прижизненной структуры. Какое свойство фиксатора главным образом обуславливает этот эффект?

А. Способность быстро проникать в ткани

В. Способность коагулировать белки

С. Способность аккумулироваться в ткани

D. Нетоксичность

Е.Бактерицидность