Хромосомы типа ламповых щеток

Еще одним примером клеток, в которых хорошо различимы транскрипционно активные хромосомы, являются незрелые яйцеклетки, или ооциты. Усиленный синтез РНК в них сопровождается растяжением длинных хроматиновых петель, к которым присоединены многочисленные новообразованные транскрипты, упакованные в РНК-комплексы. Эти, так называемые, хромосомы типа ламповых щеток хорошо видны в световой микроскоп, хотя они не очень конденсированы.

Хромосомы типа ламповых щеток появляются во время диплонемы мейоза при образовании половых клеток у большинства позвоночных, беспозвоночных и зеленых водорослей. Содержание ДНК в таких хромосомах соответствует норме, они не политенны (каждая хромосома содержит две молекулы ДНК).

В хромосомах типа ламповых щеток, помимо петлеобразной укладки суперспирали в виде ерша, имеются отдельные значительно вытянутые сим­метричные петли, выступающие над поверхностью основной структуры хро­мосомной укладки.

Обычно во время клеточного деления РНК не синтезируется, а хромосомы типа ламповых щеток, по-видимому, создают запас РНК для последующих стадий развития. Наблюдаемые структуры типа ламповых щеток представляют собой транскрипционно активный хроматин и не являются типичными для соматических клеток.

Хромосомы человека

Все, что изложено выше относительно химического состава и структуры хромосом эукариот, типично и для хромосом человека. Некоторой детализации требует информация, позволяющая идентифицировать с большей степенью точности любую хромосому человека.

1956 год - шведы Тио и Леван, англичане Форд и Хамертон установили, что ядро диплоидной клетки человека содержит 46 хромосом – это хромосомный набор или кариотип человека; в 1960 – Мурхед и сотр. (США) разработали метод приготовления препаратов хромосом из кратковременной культуры лимфоцитов; в 1968-70 гг. разработаны методы дифференциального окрашивания хромосом, что позволило однозначно идентифицировать все хромосомы человека - все эти манипуляции производились и производятся только на метафазных хромосомах, ибо они различимы лучше все­го, т.к. они максимально укорочены и утолщены, лежат свободно одна от дру­гой, располагаются все в одной плоскости клетки (экваториальной); кроме того, исследуются только те метафазные хромосомы, хроматиды которых отделились друг от друга в области плечей, а в центромерной части еще соединены.

Совокупность всех метафазных хромосом, расположенных относительно произвольно в экваториальной плоскости клетки, именуется метафазной пластинкой или просто хромосомным набором. После приготовления препаратов хромосом, которые можно приготовить из всех тканей и клеточных суспензий, содержащих делящиеся клетки (в зависимости от целей важно, конечно, количе­ство метафаз), хромосомы окрашиваются, ибо только после этого их можно различить в световой микроскоп, получить микрофотографию, идентифицировать и, расположив их в определенном порядке, т.е. составив кариограмму, получить целостное представление о кариотипе конкретного человека. Кариограмма - это те же хромосомы метафазной пластинки, но расположенные упорядоченно. Принцип упорядоченности общий для всего вида и определяется идеограммой. Идиограмма - это графическое изображение гаплоидного набора хромосом (можно и диплоидного) и расположение их по группам в зависимости от формы и величины. Группы располагаются в порядке уменьшения величины входящих в них хромосом.

В современных цитогенетических лабораториях процесс составления кариограммы компьютеризирован.

Наиболее простой способ окрашивания хромосом красителем Гимза или 2%-ым ацетоорсеином, или 2%-ым ацетокармином. При этом хромосомы окрашиваются целиком, равномерно и интенсивно. Окрашенные таким образом хромосомы, согласно Денверской классификации (I960), располагались в идиограмме в зависимости от их длины и нумеровались по парам от 1 до 23. Тогда же Патау предложил разбить 23 пары хромосом на 7 групп от А до G с учетом расположения центромеры. Важным признаком, уточняющим форму хромосомы, стал центромерный индекс: отношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы, выраженное в %. Комплекс этих параметров позволял с немалой степенью точности распределить хромосомы по группам, но идентифицировать их, особенно в группах В, С, D, F и G, было невозможно.

Однако уже при стандартном (рутинном) равномерном окрашивании хромосом замечали, но оставили без внимания, некоторую неоднородность в плот­ности окрашивания по длине хромосом. И только позже (1968 г.), когда Касперсон с сотрудниками обнаружили, что после обработки акрихин-ипритом флуоресценция по длине хромосом распределена не равномерно, а в виде сегментов, они показали, что каждую хромосому можно надежно идентифицировать с помощью такого метода дифференциального окрашивания, ибо расположение сегментов для каждой хромосомы строго специфично. Вскоре стало ясно, что очень сходный рисунок сегментации хромосом можно получить и с помощью красителя Гимза, дополнив окрашивание некоторыми приемами. Впоследствии при разных способах обработки хромосом были обнаружены разные типы сегментов.

На Парижской конференции по стандартизации и номенклатуре хромосом человека (1971) все полученные к тому времени данные по дифференциальному окрашиванию хромосом были сопоставлены и оказалось, что все методы в принципе выявляют одни и те же структуры, но каждый специфичен в отношении определенных сегментов. И обозначать различные типы сегментов решили по методам, с помощью которых они выявляются.

Q - сегменты - флуоресцирующие после окраски акрихин-ипритом;

G - сегменты (Гимза) - выявляются при окрашивании красителем Гимза в сочетании с дополнительными процедурами; Q и G сегменты идентичны, но в большинстве лабораторий предпочитают этот метод, т.к. он не требует использования флуоресцентного микроскопа и эти препараты дольше хранятся; однако, только с помощью Q-метода можно идентифицировать Y-хромосому человека даже в интерфазном ядре;

R - сегменты - окрашиваются после контролируемой тепловой денатурации, располагаются между Q и G - сегментами;

С - сегменты - конститутивный гетерохроматин, располагается в прицентромерных районах обоих плечей хромосомы;

Т - сегменты - расположены в теломерных (концевых) районах хромосом.

Химическая природа дифференциального окрашивания еще только исследуется. Обсуждаются две основные гипотезы: первая исходит из того, что различные участки хромосом человека отличаются по количественному содержанию пар оснований аденин - тимин и гуанин - цитозин. Отсюда разная сте­пень усвоения ими красителей. В частности, блоки с большим содержанием пар А-Т связываются преимущественно с акрихин-ипритом, следовательно, Q-сегменты соответствуют участкам, богатым А-Т - парами; R-сегменты соответствуют участкам, богатым Г-Ц - парами, которые более устойчивы к тепловой денатурации - это, однако, не объясняет всех особенностей сегментации хромосом. Вторая гипотеза, белковая, исходит из данных о том, что предварительная протеолитическая обработка перед окрашиванием красителем Гимза индуцирует появление G-сегментов, а так как разные по составу участки ДНК связаны с разными белками, можно полагать, что рисунок сегментации зависит от особенностей комплекса ДНК - белок.

И все же, что собой представляют полосы - сегменты митотических хромо­сом, остается загадкой. Даже небольшие тонкие полосы содержат не менее 30 гигантских петель, суммарный нуклеотидный состав которых более 1 млн., нуклеотидов. Возможно, существование таких структурных блоков связано с функционированием эукариотического генома вообще, хотя сами по себе сег­менты ничего конкретного о функционировании индивидуальных генов не гово­рят, ибо в самой тонкой полосе, которую еще можно различить, содержится от 10 до 100 генов. Но то, что картина распределения сегментов в хромосомах поч­ти не изменилась за долгие периоды эволюции (почти каждая хромосома человека имеет своего аналога в кариотипе шимпанзе, гориллы, орангутана), свидетельствует о большом значении пространственной организации ДНК для экспрессии соответствующих генов.

Итак, информация, полученная в результате анализа дифференциально окрашенных хромосом, позволяет представить идиограмму хромосом человека следующим образом:

Группа А, 1-3 хромосомы - большие метацентрические и субметацентрические хромосомы; 1-ая - самая большая метацентрическая, центромерный ин­декс (ЦИ) 48 - 49%, в длинном плече вблизи центромеры часто обнаруживается вторичная перетяжка; вторая самая большая субметацентрическая ЦИ 38-40%; 3-я -почти на 20% короче 1 -ой, ЦИ 45-46%, метацентрическая.

Группа В, 4 и 5 хромосомы - большие субметацентрические. ЦИ 24-30%, без дифференциального окрашивания друг от друга не отличаются.

Группа С, 6-12 хромосомы и Х-хромосома - средние Субметацентрические хромосомы 6, 7, 8,11 и 12 - относительно субметацентрические, ЦИ - 27-35; 11 и 12 обнаруживают очень сходный рисунок сегментации, однако 11-я хромосома более метацентрическая; в 9-й в длинном плече часто обнаруживают вторич­ную перетяжку, которая не окрашивается ни акрихином, ни красителем Гимза; Х-хромосома значительно варьирует по длине, в целом сходна с самыми длинными из С-группы, ЦИ - 40,12+2,12, отличить от других при стандартном окрашивании очень трудно.

Группа D_, 13-15 хромосомы - акроцентрические, ЦИ около 15 -наименьший в кариотипе человека, все они могут иметь вторичную перетяжку на коротком плече или не иметь, а следовательно, иметь спутники или не иметь, спутники могут быть очень большими, а иногда двойными; короткие плечи этих хромосом содержат ядрышковый организатор.

Группа Е, 16-18 хромосомы - относительно короткие метацентрические и субметацентрические; 16 - ЦИ - около 40, длина вариабельна, в длинном плече в 10% случаев выявляется вторичная перетяжка; 17-я, ЦИ -31; 18-ая хромосома на 5 -10%короче17,ЦИ-26.

Группа F, 19, 20 хромосомы - мелкие метацентрические, ЦИ - 36-46, при стандартной окраске выглядят одинаково, при дифференциальной - резко отличаются.

Группа G, 21, 22, Y-хромосомы - мелкие акроцентрические, ЦИ - 13-33; 21 и 22-ая могут иметь спутники, короткие плечи имеют ядрышковый органи­затор; Y-хромосома обычно (но не всегда) больше, хроматиды ее длинного плеча, как правило, лежат параллельно одна другой, а у 21 и 22 - ой хромосомы они чаще образуют широкий угол; спутники в Y-хромосоме отсутствуют, ЦИ от 0 до 26. В интерфазных ядрах дистальный участок длинного плеча при ок­рашивании акрихин-ипритом сильно флуоресцирует и выявляется как яркое пятно, которое называется Y-хроматин.

В соответствии с Парижской номенклатурой в хромосомах идиограммы показан рисунок сегментации (G - Q, R - сегменты) - позитивные светлые G (они же Q) сегменты, негативные темные - R, районы с варьирующей окраской заштриховываются. Латинскими буквами р и q обозначаются соответственно короткое и длинное плечо, в каждом плече выделяются районы, обозначенные арабскими цифрами, районы нумеруются от центромеры к теломерным участкам хромосомы. А уже внутри района выделяются сегменты (англ. bands), обозначенные арабскими цифрами по такому же принципу, т.е. сегмент имеет свой символ, например, 1 q 32 - второй сегмент третьего района в длинном плече 1 -ой хромосомы (при чтении справа налево).

Если в заключение сформулировать интегральную модель хромосомы, то она состоит из единственной двойной спирали ДНК, объединенной с гистонами в нуклеосомы. Некоторые районы этой двойной спирали представлены по­вторяющимися последовательностями, которые могут быть рассеяны по всему геному. Участки с повторяющимися последовательностями обнаруживают признаки конститутивного гетерохроматина. Участки с уникальными последовательностями пар нуклеотидов проявляют свойства эухроматина, это транскрибирующиеся участки - т.е. собственно гены, они соответствуют светлым G- и темным R-сегментам дифференциально окрашенных хромосом.

Благодаря успехам в молекулярной генетике человека разработан принципиально новый метод изучения хромосом – метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) (in situ – в месте нахождения).

Суть этого молекулярно-цитогенетического метода заключается в следующем:

1 – для изучаемой хромосомы или ее конкретного участка готовят комплементарный однонитевой участок ДНК, к которому присоединяют биотин или дигоксигенин, - такой помеченный участок ДНК называется зондом;

2 – на микроскопическом препарате хромосом (in situ) при обработке щелочью хромосомная ДНК денатурирует, т.е. разрываются водородные связи между двумя комплементарными нитями ДНК;

3 – полученным ранее зондом обрабатывают препарат – зонд присоединяется к хромосоме в комплементарном участке ДНК, происходит ренатурация – между зондом и соответствующим участком молекулы ДНК формируются водородные связи;

4 – затем препарат обрабатывают веществом, которое избирательно может присоединяться к биотину или дигоксигенину, после чего к зонду можно присоединить флюоресцентный краситель (или красный – родамин, или зеленый – флюоресцеина изотиоцианат);

5 – теперь с помощью люминесцентного микроскопа можно увидеть окрашенные хромосомы на фоне неокрашенных.

Можно использовать не только двух – но и трехцветные варианты метода.

Метод FISH применяется очень широко – от определения локализации гена, до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами. Он требует меньше времени, чем кариотипирование дифференциально окрашенных хромосом.

Метод FISH можно применять для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах – интерфазная цитогенетика. Например, в течение нескольких часов можно получить информацию о количестве 21 - х хромосом в клетках амниотической жидкости (пренатальная – дородовая диагностика синдрома Дауна у плода) – специфический ДНК – зонд для 21 - ой хромосомы покажет в ядрах этих клеток или 2 - е светящиеся точки, что соответствует двум 21-м хромосомам, или три – что выявит трисомию по 21-ой хромосоме.