Дослід 2. Напівкількісний метод визначення копропорфіринів (КП) у сечі.

Принцип методу. Копропофірини мають властивість у кислому середовищі в присутності ефіру давати флюоресценцію в потоці УФ-світла.

Матеріальне забезпечення: пробірки, ефір, ацетатна кислота, хроматоскоп.

Хід роботи. До 5 мл сечі в пробірці з притертим корком добавляють декілька крапель крижаної ацетатної кислоти (до кислої реакції за лакмусовим папірцем), потім доливають 5 мл ефіру і суміш енергійно струшують впродовж 3 – 5 хв. Після відстоювання і розділення шарів спостерігають флюоресценцію у верхньому шарі у потоці УФ-світла. Вміст копропорфіринів визначають у балах за такою шкалою:

1 бал – блакитна флюоресценція – нормальний вміст КП;

2 бали – ледь помітна рожева –слабке збільшення концентрації КП;

3 бали – чітка рожева – середнє збільшення концентрації КП;

4 бали – слабка червона – сильне збільшення концентрації КП;

5 балів – чітка червона флюоресценція – дуже сильне збільшення концентрації КП.

Клініко-діагностичне значення. Спадкова копропорфірія зумовлена дефіцитом копропорфіриногеноксидази – мітохондріального ферменту, який каталізує перетворення копропорфіриногену ІІІ на протопорфірин ІХ. У крові накопичується копропорфіриноген ІІІ, який у великих кількостях виділяється з калом і сечею та окиснюється в пігмент червоного кольору – копропорфірин. У таких хворих підвищена світлочутливість шкіри. Введення гематину полегшує симптоми.

 

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Яким методом можна визначити загальний і зв’язаний білірубін крові?

 

2. Яка концентрація білірубіну в крові здорової людини?

 

3. Субстрати мікросомальних гідроксилаз індукують синтез молекул цитохрому Р-450 в печінці. Висока індукуюча здатність властива фенобарбіталу (снодійному препарату). Як можна пояснити механізм звикання до снодійних засобів (барбітуратів) і до інших лікарських речовин, які окиснюються монооксигеназною системою ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів?

 

4. На якому принципі ґрунтується визначення копропорфіринів?

 

5. У хворої 45 років, яка страждає на еритропоетичну порфірію, спостерігається світлочутливість шкіри. Нагромадження якої сполуки в клітинах шкіри зумовлює її світлочутливість?

 

Приклади тестів “Крок-1”

1. У жінки віком 46 років із жовчнокам’яною хворобою розвинулась жовтяниця. При цьому сеча стала темно-жовтого кольору, кал – знебарвлений, у плазмі крові виявлено підвищений вміст кон’югованого (прямого) білірубіну. Який вид жовтяниці можна запідозрити?

А. Гемолітичну

B. Паренхіматозну

C. Обтураційну

D. Жовтяницю новонароджених

E. Хворобу Жільбера

2. У малюка, що народився недоношеним, спостерігається жовте забарвлення шкіри та слизових оболонок. Причиною цього стану є тимчасова нестача ензиму:

А. Порфобілінгенсинтази

B. δ-Амінолевулінатсинтази

C. Гемоксигенази

D.УДФглюкуронілтрансферази

E. Білівердинредуктази

3. У хворого із жовтяницею виявлено: підвищення у плазмі крові вмісту загального білірубіну за рахунок непрямого (вільного), у калі і сечі – вмісту стеркобіліну, вміст прямого (зв’язаного) білірубіну в плазмі крові – в межах норми. Який вид жовтяниці можна запідозрити?

А. Жовтяницю новонароджених

B. Паренхіматозну

C. Механічну

D. Гемолітичну

E. Хворобу Жільбера

4. Мати звернулася до лікаря: у дитини 5 років під дією сонячних променів на шкірі з’являються еритеми, везикулярний висип, дитина скаржиться на свербіж. Дослідження крові виявили зменшення вмісту заліза в сироватці крові, збільшення виділення з сечею уропорфіриногену І. Найбільш імовірною спадковою патологією в дитини є:

A. Копропорфірія

B. Метгемоглобінемія

C. Печінкова порфірія

D. Еритропоетична порфірія

E. Інтермітуюча порфірія

5 У клінічній практиці як індикатор активності гниття білків у кишках та функціонального стану печінки розглядається величина екскреції тваринного індикану, який утворюється в печінці в результаті реакції кон’югації:

А. Сульфування

В. Глюкурування

С. Метилування

D. Ацетилювання

Е. З гліцином

 

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Шляхи детоксикації ксенобіотиків.

2. Метаболізм порфіринів.

3. Патобіохімія жовтяниць.

 

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

3. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

4. Біохімічні показники у нормі і при патології. Навчальний довідник / За ред. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2007. – 320 c.

5. Клінічна біохімія: Підручник / Д.П.Бойків, Т.І.Бондарчук, О.Л.Іванків та ін. За ред. О.Я Склярова. - К.:Медичина, 2006. - 432 с.

Додаткова:

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – 704 с.

2. Камышников В.С. Клинические лабораторные тесты от А до Я и их диагностические профили // МЕДпрессинформ. – Москва, 2005. – 320 с.

3. Клиническая биохимия: Учебное пособие для вузов / Бочков В.Н., Добровольский А.Б., Кушлинский Н.Е. и др. – М.: ГЭОТАРМЕД, 2004. – 521с.

4. Клиническая биохимия: Учебник для студентов мед. вузов // А.Я. Цыганенко, В.И. Жуков, В.В. Леонов и др. – Харьков: Факт, 2005. – 456с.

5. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004. – С. 63 – 71, 79 – 83.

7. Справочник по лабораторным методам исследования / Под ред. проф. Л.А. Даниловой. – М. – С.-Петербург – Ниж. Новгород – Воронеж – Ростов-на-Дону – Екатеринбург – Самара – Киев – Харьков – Минск: Питер, 2003. – 733 с.

 

Тема № 12. Водно-сольовий обмін в організмі. Дослідження нормальних і патологічних компонентів сечі.

Мета заняття. Вивчити процеси обміну води і мінеральних речовин в організмі людини. Оволодіти методами якісного та кількісного визначення неорганічних речовин у сироватці крові та вміти інтерпретувати отримані результати. Знати фізико-хімічні властивості сечі; основні біохімічні показники нормальних і патологічних компонентів і шляхи їх проникнення в сечу. Вміти провести біохімічний аналіз сечі та інтерпретувати отримані результати.

Актуальність теми. У зв’язку з тим, що для життєдіяльності організму людини присутність води і неорганічних речовин є обов’язковою, проте може змінюватись при різних захворюваннях. Знання і розуміння процесів їх обміну, а також їх якісне і кількісне визначення є необхідним для оцінки водно-мінерального обміну. Біохімічний аналіз сечі є обов’язковим в амбулаторних і клінічних умовах у діагностуванні низки захворювань і дає можливість судити про функціональний стан нирок, обмін речовин у різних органах і організмі в цілому, допомагає вияснити причини, характер і прогноз патологічного процесу, дозволяє оцінити ефективність лікування. Крім того, дослідження сечі на вміст лікарських речовин або їх метаболітів дозволяє також оцінити фармакологічну дію ліків і прогнозувати терапевтичний ефект.

Конкретні завдання.

Ø Трактувати біохімічні механізми регуляції водно-сольового обміну та роль нирок в утворенні сечі.

Ø Аналізувати біохімічний склад сечі в нормі та за умов розвитку патологічних процесів; оцінювати функціональне значення кінцевих продуктів азотистого обміну (сечовина, сечова кислота, креатинін) та продуктів детоксикації (тваринний індикан, гіпурова кислота), зміни їх добового виділення.

Ø Аналізувати стан здоров’я людини на підставі біохімічних параметрів змін проміжних та кінцевих продуктів метаболізму в крові та сечі.

 

Теоретичні питання

1. Водно-сольовий обмін в організмі. Внутрішньоклітинна та позаклітинна вода. Обмін води, натрію, калію.

2. Роль нирок у регуляції об’єму, електролітного складу та рН рідин організму. Біохімічні механізми сечоутворювальної функції нирок (фільтрація, реабсорбція, секреція й екскреція). Біохімічна характеристика ниркового кліренсу та ниркового порогу, їх діагностичне значення.

3. Ренін-ангіотензинова система нирок. Біохімічні механізми виникнення ниркової гіпертензії. Гіпотензивні лікарські засоби – інгібітори ангіотензинперетворювального ферменту.

4. Фізико-хімічні властивості сечі: кількість, колір, запах, прозорість, реакція (рН), залежність її від складу їжі. Роль нирок і легенів у підтриманні кислотно-основного стану організму. Амонійогенез.

5. Біохімічний склад сечі людини в нормі.

6. Біохімічний склад сечі людини за умов розвитку патологічних процесів. Клініко-діагностичне значення аналізу складу сечі.

 

Практична робота

Дослід 1. Фізико - хімічні властивості сечі.

Матеріальне забезпечення: сеча, мірний циліндр, колбочки, набір урометрів, індикаторний папір „Ріфан”, піпетки, пробірки.

Визначення кількості сечі. Виділення сечі за певний проміжок часу (за день, ніч або за добу) називається діурезом. Об’єм сечі вимірюють мірним циліндром по нижньому меніску.

Клініко - діагностичне значення: У нормі доросла людина за добу виділяє в середньому 1100 – 1800 мл сечі. Поліурія – збільшення виділення сечі (понад 2000 мл) – може бути фізіологічною (за рахунок вживання великої кількості рідини або при нервовому збудженні) і патологічною (при цукровому та нецукровому діабетах, захворюваннях нирок, при вживанні сечогінних і серцевих лікарських засобів). Олігурія – зменшення виділення сечі (600 мл і менше) – може бути фізіологічною (при обмеженому вживанні рідини, втраті рідини з потом) і патологічною (при запаленні нирок, частих проносах, гарячкових станах, блюванні, вадах серця). Анурія – повне припинення виділення сечі – часто спостерігається при закупорці сечоводів (нирковий камінь, пухлина). Така анурія називається неістинною. Істинна анурія виникає при порушенні сечовидільної функції нирок (гостра ниркова недостатність, тяжкі форми гострого гломерулонефриту, отруєння ртуттю, свинцем).

Колір сечі. Колір сечі визначають у склянці з безбарвного скла у відбитому світлі на білому тлі.

Клініко - діагностичне значення. У нормі колір сечі дорослої людини солом’яно-жовтий завдяки таким пігментам, як урохром, уробілін, уроеритрин тощо. У новонароджених сеча майже безбарвна.

При патологічних станах можуть відбуватися як якісні, так і кількісні зміни у забарвленні сечі.

Якісні зміни кольору сечі залежать від наявності в ній білірубіну та гемоглобіну. При гематурії ниркового походження сеча набуває кольору “м’ясних помиїв”, при жовтяниці – кольору “пива”, при вживанні деяких ліків (амідопірин, ацетилсаліцилова кислота) і при отруєнні карболовою кислотою колір сечі стає рожево-червоним. Червоний колір сечі спостерігається при порфіринурії (первинна порфіринурія виникає внаслідок ензимопатії, наприклад, спадкова хвороба Гюнтера, при якій з сечею виділяється багато уропорфіринів і копропорфіринів типу І; вторинна – при інтоксикаціях із подальшим ураженням печінки).

При збільшенні діурезу змінюється інтенсивність кольору сечі. Інтенсивне забарвлення спостерігається при олігурії або при посиленому виділенні пігментів, зокрема білірубіну (гемолітична жовтяниця). Слабке забарвлення сечі буває при поліурії (нефросклероз, нецукровий і цукровий діабети, швидке розсмоктування набряків тощо).

При вживанні буряків, моркви, суниць сеча забарвлюється різними пігментами, що містяться в цих продуктах.

Молочно-білий колір сечі спостерігають при хілурії внаслідок розриву лімфатичних капілярів нирки, великому вмісту ліпідів, фосфатів і домішок гною.

Запах сечі. У нормі свіжа сеча має специфічний запах летких речовин, що в ній містяться. Аміачний запах сечі виникає при запаленні сечового міхура (цистит), гнильний – при гангренозних процесах, плодовий або винний, запах ацетону – у хворих на діабет. Запах сечі може бути пов’язаний із характером їжі (часник, спаржа) або вживанням деяких медикаментів (запах валеріани, ментолу тощо).

Прозорість сечі. Прозорість сечі визначають у склянці з безбарвного скла після збовтування.

У нормі свіжа сеча завжди прозора. З часом у ній починається лужне бродіння, тому сеча стає каламутною. Розрізняють сечу прозору, слабко каламутну, каламутнувату і різко каламутну.

Причиною каламутності різної інтенсивності може бути наявність у сечі солей (у лужному середовищі фосфатів, а в кислій сечі – уратів), слизу, кліткових елементів і бактеріальної флори (цистопієліти). Дуже рідко каламутність спричинюють жири (при переломах великих кісток). Щоб відрізнити патологічне походження каламутності (осаду) сечі від звичайної сольової каламуті, треба провести відповідні хімічні і мікроскопічні дослідження.

Хімічне дослідження на розрізнення організованих осадів від неорганізованих. Всі елементи сечових осадівподіляють на дві великі групи: організовані і неорганізовані. Неорганізований осад складається з солей і кристалічних утворів, що наявні як у нормальній, так і в патологічній сечі. Солі осаду різні в залежності від реакції сечі. До неорганізованих елементів осаду у кислій сечі належать аморфні урати, сечова кислота, оксалати, у лужній – аморфні фосфати, трипельфосфати, амонію урат. До організованих елементів осаду сечі належать всі клітинні елементи: еритроцити, лейкоцити, епітеліальні клітини (плоскі, циліндричні і круглі).

Матеріальне забезпечення: сеча,10 % розчин ацетатної кислоти, 5 % розчин гідроксиду натрію, пробірки.

Хід роботи. У 2 пробірки наливають по 5 мл сечі і додають у першу пробірку 1 мл 10 % ацетатної кислоти, а у другу – 1 мл 5 % гідроксиду натрію і нагрівають.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Неорганізовані осади (фосфати, карбонати, оксалати) розчиняються у кислотах, а урати – в лузі. Якщо в лужному середовищі каламуть не зникає навіть після додавання 3 – 5 крапель концентрованого розчину NaOH, тоді ця каламуть зумовлена наявністю клітинних елементів (епітелій, лейкоцити, еритроцити, слизь).

Організовані елементи відрізняються від неорганізованих тим, що вони дуже повільно зсідаються і не розчиняються при нагріванні і додаванні кислот.

Реакція сечі. Визначення рН сечі за допомогою індикаторного паперу. На середину індикаторного папірця “Ріфан” наносять 1 – 2 краплі свіжої сечі і за зміною забарвлення одної із забарвлених смужок, яка співпадає з кольором контрольної смуги, визначають рН сечі.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки. Точніше визначають рН сечі потенціометричним методом.

Клініко-діагностичне значення. Реакція сечі (рН) у здорової людини коливається в нормі від 4,5 до 8,0. На неї може впливати склад їжі і патологічні стани. Наприклад, лужну реакцію сечі спостерігають при блюванні, фосфатурії, запаленні сечового міхура (цистит) і ниркових мисок (в останніх двох випадках бактеріальна флора розкладає сечовину на аміак), вагітності, вживанні лужних мінеральних вод. Більш кисла реакція сечі буває при цукровому діабеті та голодуванні (внаслідок нагромадження у сечі кетонових тіл), тяжкій нирковій недостатності внаслідок порушення функції нирок і зменшення вмісту аміаку, що нейтралізує сечу. Дуже кисла реакція спостерігається при подагрі і гарячковому стані.

Великий вплив на реакцію сечі має характер харчування. При посиленому білковому харчуванні (м’ясо) сеча стає більш кислою, якщо переважає рослинна їжа – більш лужною.

Густина сечі. Сечу наливають у вузький циліндр на 100 мл і стежать, щоб не утворилась піна. Якщо ж піна утворилася, то її знімають фільтрувальним папером. Утворенню піни можна запобігти, якщо наливати сечу у циліндр по його стінці. У циліндр обережно опускають урометр і, коли він перестане коливатися, визначають густину по нижньому меніску. Урометр при цьому повинен вільно плавати в циліндрі і не торкатися його стінок.

Якщо досліджуваної сечі мало, її треба розвести дистильованою водою, визначити питому вагу і добутий показник (дві останні цифри) помножити на розведення.

Наприклад, якщо для аналізу взяли 20 мл сечі, то її розводять в циліндрі дистильованою водою у 2 рази (до 40 мл) і вимірюють густину. Якщо вона рівна 1,006, тоді істинна густина дорівнює 1,012. Такий спосіб визначення густини сечі дуже важливий для педіатричної практики.

Кожний урометр калібрований для певної, вказаної на ньому температури. Якщо визначення роблять при іншій температурі, тоді вносять поправку: на кожні 3ºС вище вказаної температури до показника урометра додають по 0,001, якщо температура нижче,тоді на кожні 3ºС – віднімають по 0,001.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко - діагностичне значення. У нормі густина сечі при температурі 15ºС коливається від 1,014 до 1,025. Густина сечі характеризує концентраційну здатність нирок, тому що вона дає уявлення про концентрацію речовин, розчинених у сечі (першою чергою, сечовини та солей натрію). Густина сечі впродовж доби може змінюватися (нічна сеча у нормі більшої густини, ніж денна) і залежить від кількості спожитої рідини та кількості рідини, виділеної з потом і калом.

При нецукровому діабеті густина сечі коливається від 1,001 до 1,004, а при цукровому діабеті досягає 1,030 – 1,040 і більше. На кожний 1 % цукру в сечі вноситься поправка в густину на 0,004. Протеїнурія також впливає на густину сечі – 3 г/л збільшує її на 0,001.

Підвищення густини спостерігають при гарячкових станах, блюванні, проносах, деяких хворобах нирок.

Низька густина буває при тяжких розладах функції нирок, нервових захворюваннях, нецукровому діабеті.

Виділення впродовж тривалого часу сечі зі стабільною густиною, показник якої дорівнює густині первинної сечі (1,010 – 1,011), називається ізостенурією.

Гіпостенурію – часткову втрату нирками здатності концентрувати і розбавляти сечу – спостерігають при частому виділенні сечі, густина якої 1,007 – 1,015. При цьому функціональна здатність нирок частково зберігається, але прогноз також несприятливий.