Вопрос №36: принципы создания вс для животных.

Эукариотический вектор представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться в клетках животных. Помимо последовательностей нуклеотидов, обеспечивающих репликацию, эукариотические векторы могут содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках животных и растений, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно, эукариотические векторы должны быть челночными векторами. Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых ферментативными системами эукариотических клеток.

В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид встречаются редко. Поэтому при конструировании векторов, способных реплицироваться и осуществлять экспрессию в клетках животных, чаще всего используют регуляторные генетические элементы вирусов животных или эукариотических генов домашнего хозяйства и генов, для которых характерна тканеспецифическая экспрессия.

Манипуляции с клетками млекопитающих можно разделить на 2 большие группы: эксперименты с соматическим клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат – получение трансгенных организмов.

Одними из лучших носителей для введения чужеродной информации в животную клетку являются вектора на основе ретровирусов, например, на основе вируса лейкоза мышей. Они обеспечивают высокоэффективный перенос генов и их стабильное встраивание в хромосому клеток-мишеней. В основном трансформации животных клеток осуществляют либо с помощью ретровирусов (около 40% от всех трансформаций), либо путем упаковки ДНК в липосомы (25%), реже используют аденовирусы, так как они могут вызывать сильный иммунный ответ, кроме того, невозможно их повторное введение.

Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем - стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность — все еще нуждаются в серьезных доработках.

Прежде всего это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем, либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительной персистенции внутри ядер).

В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (MAC - mammalian artificial chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время. Такие искусственные хромосомы уже созданы для дрожжей (YAK), так как геном дрожжей полностью картирован.

Для идентификации модифицированных клеток, необходимы маркеры. Если трансформируют соматические клетки, то применяют обычно селективные маркеры. Аксель с коллегами из колледжа терапии и хирургии Колумбийского университета исправили таким образом генетический дефект клеток мыши. Они взяли фрагмент ДНК, содержащий ген тимидинкиназы (ТК), который получен из вируса герпеса, смешали эту ДНК с несколькими миллиграммами ДНК-носителя из спермы лосося и осадили ДНК на культуру L-клеток мыши, в которых ген ТК отсутствовал (ТК-). С частотой 1 на 100000 клетки приобретали ген ТК, поэтому на селективной среде, которая не позволяла расти ТК- - клеткам, росли и нормально размножались ТК+ - клетки.

Другой селективный маркер - ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ДГФР), можно использовать при трансформации немутантных линий клетки. Благодаря экспрессии многих копий этого гена животная клетка вместе с плазмидой приобретает устойчивость к высоким концентрациям ингибитора фермента, и таким образом трансформантов можно отбирать при высоких концентрациях ингибитора.

Разработано еще два универсальных вектора, содержащих генные маркеры, работающие в нормальных клетках. Они построены по одному и тому же принципу: прокариотические гены, определяющие фенотип трансгенных клеток, соединены с эукариотическими регуляторными сигналами.

Один из векторов состоит из прокариотического гена устойчивости к антибиотику неомицину, встроенного в раннюю область генома SV-40. Эукариотические клетки чувствительны к аналогу неомицина G 418, который инактивируется продуктом гена. Таким образом клетки, прошедшие трасфекцию приобретают способность расти на среде, содержащей G 418.

ВОПРОС №37: ОРГАНИЗАЦИЯ ВИРУСА SV40.
Вирус SV40 относится к роду Polyomavirus семейства Polyomaviridae и является мелким вирусом,двухцепочечная кольцевая ДНК которого реплицируется в ядре хозяйсткой клетки.Может размножаться вегетативно или в интегрированном в хромосомы состоянии.
Полная последовательность составляет 5243 п.н ДНК SV40.Кольцевая ДНК вируса SV40 яркий пример использования последовательности нуклеотидов для кодирования различных функций.Гены в значительной степени перекрываются.Область начала репликации перекрывается с промоторными послдовательностями,направляющими раннюю и позднюю транскрипцию.Ранний промотор устроен сложно.Имеет ТАТА-бокс на расстоянии -30 п.н..Дополнительные элементы промотора располагаются на расстоянии 115 п.н. от точки инициации и представляют собой два прямых повтора последовательностей длинной 21 п.н. С этой облстью свзяывается клеточный фактор SP1.Затем SP1 взамиодействует с другими белками,в результате чего формируется комплекс,необходимый для транскрипции,осуществляемый РНК-полимеразой 2.
В результате альтернативного сплайсинга формируются молекулы зрелых мРНК,кодирующие большой(Т) и малый (t) т-антигены.Т-антиген является единственным белком вируса,который небходим для эффективной репликации вирусной ДНК в инфицированных клетках.Он обладает ДНК-хеликазной активностью.Т-хеликаза входящая в репликативный ферментный омплекс SV40,отличается от клеточной тем что обуславливает эффектную многократную инициацию репликации вирусной ДНК на протяжении одного цикла клетки.Т-антиген осуществляет авторегуляцию экспрессии своего гена.Способен индуцировать и поддерживать состояние онкогенной трансформации широкого спектра культур кеток млекопитающих.Малый t-антиген необходим для неопластической трансформации наряду с Т-антигеном,усиливает его действие или не требуется вовсе.Участок ori является единственным районом генома SV40,который необходим для репликации вирусной ДНК.Имеется энхансерная область которая ускоряет транскрипцию в 200раз.Кроме усилителей были обнаружены сайленсеры,которые подавляяют транскрипцию.Наличие усилителей и глушителей позваляет осуществлять тонкое регулирование транскрипции.Репликация инициируется в единственном участке ori,минимальный размер которого 65 п.н.,и происходит двунаправленно.Данный вирус позволяет изучать регуляцию экспрессии генов,репликацию ДНК,сплайсинг пре-мРНК,ДНК белковые взаимодействия.

ВОПРОС №38. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ВИРУСА SV40.
Литические векторы на основе SV40(вирусы): Из-за насыщенности генетической структуры вируса SV40 лишь в ограниченном числе мест на его ДНК могут происходить незначительные перестройки типа вставок или делеций без потери жизнеспособности вируса. При встройке в ДНК данного вируса чужеродного фрагмента по любому из уникальных мест гидролиза рестриктазами будет происходить нарушение той или иной функции, т. е. гибридные вирусы SV40 будут дефектны. Чтобы гибридная ДНК могла упаковаться в вирусный капсид, ее размер должен составлять 70-100 % генома вируса. Поэтому для получения гибридного вирусного потомства необходимо чужеродный фрагмент ДНК встраивать в мо­лекулу вирусной ДНК, у которой предварительно с помощью рестриктаз делетирован определенный район. Такие векторы являются векторами замещения. Обязательное условие при конструировании гибридных вирусов — сохра­нение неповрежденной области начала репликации вирусной ДНК. Нарушенные при встройке в векторную ДНК другие вирусные функции необходимо комплементировать с помощью ви- руса-помощника. Молекулярные векторы данного типа на основе ДНК вируса SV40 называют литическими векторами. В большей части выполненных исследований гибридные вирусы SV40 получены замещением участка ДНК из области поздних генов вируса фрагментом чужеродной ДНК. Гибриды данного типа содержат полностью область ранних генов и репликатор вируса SV40 и могут размножаться в виде вирусных частиц при совместной инфекции пермиссивных клеток с вирусом-помощником дикого типа или термочувствительным мутантом по ранним генам (обычно tsA). Для встройки фрагментов ДНК в область поздних генов вируса SV40 можно использовать рестриктазы Нра\\, ЕсоШ, ВатШ, НаеII, Accl, Kpnl, имеющие уникальные места гидролиза на вирусной ДНК, а также Hhal, имеющую два участка гидролиза (см. рис. 14.1). При использовании других рестриктаз обычно проводят неполный гидролиз вирусной ДНК, продукты гидролиза разделяют электрофорезом и векторный фрагмент ДНК SV40 выделяют из геля.
Нелитические векторы на основе генетических элементов SV40(плазмиды): Векторы данного типа являются бифункциональными плазмидами, способными реплицироваться как в клетках Е. coli, так и в клетках млекопитающих. В клетках млекопитающих, не поддерживающих их репликацию, плазмиды могут интегрироваться в геном. Поэтому их называют эписомными векторами. Такие плазмиды конструируют встройкой в бактериальную векторную плазмиду целого генома или фрагмента ДНК вируса SV40. Встраиваемый вирусный фрагмент обычно содержит нативный вирусный репликатор, один или два промотора, а также в некоторых случаях — вирусные сигналы сплайсинга и полиаденилирования мРНК.В первых экспериментах по конструированию челночных плазмид на основе pBR322 и генома SV40 выяснилось, что в бактериальной плазмиде имеется последовательность, значительно снижающая уровень экспрессии эукариотических генов. Данная последовательность расположена в pBR322 между точкой гидролиза рестриктазой Pvull и областью начала репликации плазмиды. Делеция этого района приводит к тому, что челночная плазмида pBR-SV40 реплицируется в клетках COS с такой же эффективностью, что и нативная вирусная ДНК, и ее копийность достигает 105 молекул на клетку. Благодаря эффективной репликации и транскрипции с сигналов вируса SV40 гибридные плазмиды, конструируемые на основе эписомных векторов с делетированным глушителем транскрипции, обеспечивают в клетках COS высокий уровень продукции чужеродных белков. С использованием векторов данного типа продемонстрирована экспрессия в клетках млекопитающих клонированных генов фибробластного и иммунного интерферонов человека, поверхностного антигена вируса гепатита.