Вопрос №1: ферменты рестрикции. Классификация, значение для генной инженерии. Хар-ка днк-лигаз.

ВОПРОС №1: ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ. КЛАССИФИКАЦИЯ, ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ. ХАР-КА ДНК-ЛИГАЗ.

Рестриктаз около 4 тыс.

Они делятся на 4 класса:1,2,3,4.Самый многочисленный и использующийся-2 класс.

Рестриктазы первого класса разрезают двухцепочную молекулу в произвольной точке и само место разреза не строго специально.состоит из 5 белков.

Рестриктазы третьего класса,схоже с 1 классом,состоит из 2 субъединиц.за специфическое связывание с ДНК отвечает метилаза..

Рестриктазы 2 класса:Сайт узнавания и разрезания могут находится или очень рядом, или на определенном расстоянии друг от друга. Метилаза и рестриктаза действует по разному и это делает их удобными для генной инженерии. Их характеризуют по 2 особенностям:1)по особенности сайта узнавания и 2)по характеру разрезания.

1 характеристика:П\кл2 Р-самый многочисленный и используемый.Он узнает последовательность кратное 4,6,8 нуклеотид.Сайт узнавания представлен полиндромом-последовательность от 5 штрих еонца,которая читается одинаково.

П\кл2 W:узнает нечетное количество нуклеотидов от 5 до 7.Прерывестый полиндром-в середине последовательности находится 1 из 4 нуклеотидов.

П\кл2 N:тоже прерывестый полиндром,но в середине несколько произвольных нуклеотидов,до 5.

П\кл2 S и П\кл2 Т:узнают не полиндромные последовательности. Первый разрезает на определенном расстоянии,а другой в самом сайте узнавания.

2 характеристика:Могут быть липкие концы(выступать может 3 или 5 штрих конец.).Могут быть ровные концы.

Многие ферменты выделяемые из бактерий являются изошизомерами-распознавани одинаковых последовательностей и резать одинаково.

Гетерошизомеры-распознают одинаково,но режут по разному.

Для все классов характерна зависимость от магния,но 1,3,4-зависят от атф и S-аденозилметионин.

Метилазы: Сайты узнавания в бактериальной ДНК модифицируются добавлением к ним метальной группы (—СНЗ) в процессе метилирования, который выполняется ферментами, называемыми метилазами. Метилирование не позволяет ферментам рестрикции разрезать геном в сайтах рестрикции. А вот геномы вирусов, у которых сайты рестрикции не модифицированы, могут быть разрезаны ферментами рестрикции и разрушены. Совокупность указанных процессов называется системой рестрикции и модификации.

Лигазы

В 1961 г. Мезельсон и Вейгл на примере фага l показали, что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединение молекул ДНК. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК. В 1967 году такой фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.

Иными словами, ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репарации ДНК, в процессах репликации - при удвоении цепи ДНК.

Существует 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в кофакторах и способу действия. ДНК-лигаза E. coli в качестве кофактора использует дифосфопиридиннуклеотид, а лигаза фага Т4 - АТФ в присутствии Mg2+. Лигаза фага Т4 более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она используется чаще.

 

ВОПРОС №2: РЕСТРИКТАЗЫ КЛАССА 2. КЛАССИФИКАЦИЯ. УСЛОВИЯ РЕАКЦИИ РЕСТРИКЦИИ.

Рестриктазы 2 класса:Сайт узнавания и разрезания могут находится или очень рядом, или на определенном расстоянии друг от друга. Метилаза и рестриктаза действует по разному и это делает их удобными для генной инженерии. Их характеризуют по 2 особенностям:1)по особенности сайта узнавания и 2)по характеру разрезания.

1 характеристика:П\кл2 Р-самый многочисленный и используемый.Он узнает последовательность кратное 4,6,8 нуклеотид.Сайт узнавания представлен полиндромом-последовательность от 5 штрих еонца,которая читается одинаково.

П\кл2 W:узнает нечетное количество нуклеотидов от 5 до 7.Прерывестый полиндром-в середине последовательности находится 1 из 4 нуклеотидов.

П\кл2 N:тоже прерывестый полиндром,но в середине несколько произвольных нуклеотидов,до 5.

П\кл2 S и П\кл2 Т:узнают не полиндромные последовательности. Первый разрезает на определенном расстоянии,а другой в самом сайте узнавания.

2 характеристика:Могут быть липкие концы(выступать может 3 или 5 штрих конец.).Могут быть ровные концы.

Многие ферменты выделяемые из бактерий являются изошизомерами-распознавани одинаковых последовательностей и резать одинаково.

Гетерошизомеры-распознают одинаково,но режут по разному.

Условия:буфер и температура.

Температура=37,но может быть выше или ниже.

Буфер зависит при какой ионной силой работает фермерт,есть 3 буфера:1)низкой ионной силы,2)средней ионной силой,3)высокой ионной силой.

 

ВОПРОС №4: ТЕРМИНАЛЬНАЯ ДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДИЛТРАНСФЕРАЗА, ЩЕЛОЧНЫЕ ФОСФАТАЗЫ, ПОЛИНУКЛЕОТИДКИНАЗА ФАГА Т4. ХАР-КА, ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ГЕН. ИНЖЕНЕРИИ.

Терминальная трансфераза
(концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза) была обнаружена Боллумом в 1962 году в тимусе теленка. Субстратом терминальной трансферазы при использовании в качестве кофактора ионов Mg²⁺ является одноцепочечная ДНК с З'-ОН концом или двухцепочечная ДНК с выступающим одноцепочечным З'-ОН концом. Если в качестве кофактора используются Co²⁺, этот фермент может катализировать присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами.

При введении в реакцию, направляемую терминальной трансферазой, лишь одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 1-цепочечные 3'-концы. Таким же образом можно достроить другим молекулам ДНК гомополимерные 3'-концы, комплементарные первым. Смешение полученных препаратов ДНК при определенных условиях может приводить к формированию гибридных молекул ДНК.

Именно с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы в 1972 г. был выполнен первый эксперимент по рекомбинации молекул ДНК in vitro.

Щелочная фосфатаза

Щелочная фосфатаза применяется для того, чтобы отщепить фосфатные группы на 5'-конце и предотвратить лигирование этих концов. Удаление концевых фосфатов также делает возможным введение концевой радиоактивной метки. Наиболее широко используют щелочную фосфатазу из креветок, которая также наиболее легко инактивируется после отщепления фосфата.

Полинуклеотидкиназа фага т4

Полинуклеотидкиназа (polynucleotide kinase): фермент, катализирующий присоединение фосфатной группы к концевым звеньям олигонуклеотидов и полинуклеотидов.

Полинуклеотидкиназы осуществляют перенос гамма-фосфатных групп ATP на 5'-OH группы ДНК или РНК.

Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 используется для введения радиоактивной метки в ДНК или РНК для получения радиоактивно меченных зондов или секвенирования нуклеиновых кислот.

 

Фагмиды

Фагмиды – векторы, содержащие элементы вирусной нуклеиновой кислоты и плазмиды, что дает им возможность в определенных условиях образовывать зрелые фаговые частицы или существовать в бактериальных клетках в виде плазмид.

Наиболее известные фагмиды – космиды.

 

ВОПРОС №35: ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ. ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ.ПРИМЕРЫ.

Трансгенные растения — это те растения, которым «пересажены» гены других организмов.

Принцип создания трансгенных растений и животных схожи. И в том, и в другом случае в ДНК искусственно вносятся чужеродные последовательности, которые встраивают, интегрируют генетическую информацию вида. Принципы создания т. е создание с помощью ti плазмиды.

Ti плазмиды используются в качестве векторов для растений.

Т-днк ti обладает свойствами делающими ее идеальным вектром для введения чужих генов в клетки растений. Во превых круг хозяев с которыми могут взаимодействовать агробактерии достаточно широк, все двудольные взаимодействуют с агробактериями и т-днк с тиай плазмиды может встраиваться в геном, но сейчас повторяю разработаны монипуляции которые позволяют вводить т-днк и в однодольные (в том числе и злаки) В двудольные в природе,, а в однодольные в лаборатории добились. Во вторых интегрированная в состав генома растения т-днк наследуется как простой даминантный признак в соответствии с законами менделя,, а гены которые входят в состав т-днк имеют собственные промоутеры (ген опина, цитокинина, оксина) под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в т-днк чужеродные гены. Вектора должны обладать след свойствами: 1) содержать все сигналы необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений т-днк (т.е это большая система белков которая обеспечивает ее перенос, поэтому должны обладать этими системами) 2) Содержать систему для экспрессии чужеродных генов в растениях то есть промоутерные участки; 3) Маркер селективный для отбора трансформированных клеток,,, 4)не должна т-днк содержать онко генов то есть генов которые подовляют дефиринцировку растительных клеток. Поскольку тиай плазмиды большие для конструкции векторов используют только т-днк (даже все что от нее там нада, самое главное должны быть на концах повторы которые будут узноваться системами вир белков и будет разрезаться в этих местах). Это т-днк вырезают с помощью рестриктаз и встраивают в стандартные вектора е коли,, то есть в вектора содержащие кол е репликон это может быть писи или пбр322. Дальше с помощью стандартных приемов удаляют практически все содержимое т-днк, за исключением концевых последовательностей. В т-днк встраивают определенный ген, получают гибрид писи с т-днк в который встроен ген, эту молекулу размножают. Эту плазмиду вносят в агробактерию тумефацинес которая содержит полную ti плазмиду. После попадания в клетку в результате обмена идентичными участками а именно за счет гомологичной рекомбинации между т сигментами нативной молекулы и сконструированной происходит встраивание т-днк (то есть происходит замещение исходной т –днк на чужеродную). Кол е репликон ее судьба либо исчезнуть т.к не может копироваться в этой системе либо встроиться. Таким образо в результате этого рекомбиционного обмена возникает тиай плазмида в которой т-днк представлена с чужим геном. Затем заражают растения агробактериями в которых имеется тиай с включенными чужеродными генами. В результате т-днк будет переносится в геном растительной клетки.

Примеры трансгенных растений. В настоящее время можно получить любое трансгенное растение и внедрение его в сельское хоз. В настоящее время в америке вся соя трансгенная. Когда начались создоваться трансген. Растен сразу было введено массу запретов, опасались. За прошедшие 20 лет трансгенные растения не приводят к изменению генома человека.

Повышение урожайности и изменение качества с/х продукции. Повышение урожайности должно быть связано с такими факторами как вредительство их (болезни, насекомые и т. д), соответственно для повышения урожайности следует бороться с этими факторами,но для повышения устойчивости растений к заболеваниям стратегически можно использовать два подхода: 1) вводить гены продукты которые действуют на внешних вредителей и второе это повышать устойчивость самого растения(поскольку у растений есть системы которые связаня с его устойчивостью к вредителям).

Гены таксинов например, многие растения сод гены определяющие синтез токсинов(гены бактериальные) - это край гены из бациллус перенгиенсис. То есть есть бактерии котор выделяют токсины,, гены этих токсинов и вводят в растения. Ну например хлопок, картофель (устойчивые к насекомым).. У устойчивых растений накапливается перикись водорода, салицировая кислота и фитоаликсины, повышенное содержание этих соединений усиливает защитные функции растений, поэтому генно инженерным путем добиваются увеличением выработки перикиси, салиц кисл в ответ на патоген. Второе направление: получение продуктов в виде антисмысловой РНК. Предположим у растения есть регуляторный участок и некий ген работу которого нужно уменьшить ну чтоб экспрессия шла меньше, для ослабления экспрессии вводят антисмысловую последовательность.

Например антисмысловая гена пиджи, это ген который контролирует синтез пигмента участвующего в разрушении пектина. Продукт этого ген а в растениях синтезируется в период созревания плодов (томаты), если увеличить его экспрессию то это приводит к тому что томаты становятся мягкими и сокращается их срок хранения,, отключения этого гена с помощью антсмысловой технологии позволило получить томаты плоды которых больше хранятся а сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Подход для регулирования созревания томатов еще был, в качестве мишени использовался EFE, продуктом которого является фермент участвующего в биосинтезе этилена, этилен является газообразным гормоном регулирующим созревание плодов.

Т-днк вставочный мутагенез. Встраиваясь в определенный ген он его выключает, это же выключение позволяет и облегчает путь клонирования генов растения, таким способом сейчас получено множество новых мутаций у растений и соответствующие гены клонированы. Ну например были получены растения к неспицифической устойчивостью к фитофторозу а потом они были клонированы.

Есть два пути введения чужих генов это отдаленная гибридизация которая имеет очень много сложностей то есть селекция когда вводится дикий ген путем гибридизации, либо трансгенные растения (можно ввести все что угодно, технология позволяет, можно получить любой гибрид).

ВОПРОС №1: ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ. КЛАССИФИКАЦИЯ, ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ. ХАР-КА ДНК-ЛИГАЗ.

Рестриктаз около 4 тыс.

Они делятся на 4 класса:1,2,3,4.Самый многочисленный и использующийся-2 класс.

Рестриктазы первого класса разрезают двухцепочную молекулу в произвольной точке и само место разреза не строго специально.состоит из 5 белков.

Рестриктазы третьего класса,схоже с 1 классом,состоит из 2 субъединиц.за специфическое связывание с ДНК отвечает метилаза..

Рестриктазы 2 класса:Сайт узнавания и разрезания могут находится или очень рядом, или на определенном расстоянии друг от друга. Метилаза и рестриктаза действует по разному и это делает их удобными для генной инженерии. Их характеризуют по 2 особенностям:1)по особенности сайта узнавания и 2)по характеру разрезания.

1 характеристика:П\кл2 Р-самый многочисленный и используемый.Он узнает последовательность кратное 4,6,8 нуклеотид.Сайт узнавания представлен полиндромом-последовательность от 5 штрих еонца,которая читается одинаково.

П\кл2 W:узнает нечетное количество нуклеотидов от 5 до 7.Прерывестый полиндром-в середине последовательности находится 1 из 4 нуклеотидов.

П\кл2 N:тоже прерывестый полиндром,но в середине несколько произвольных нуклеотидов,до 5.

П\кл2 S и П\кл2 Т:узнают не полиндромные последовательности. Первый разрезает на определенном расстоянии,а другой в самом сайте узнавания.

2 характеристика:Могут быть липкие концы(выступать может 3 или 5 штрих конец.).Могут быть ровные концы.

Многие ферменты выделяемые из бактерий являются изошизомерами-распознавани одинаковых последовательностей и резать одинаково.

Гетерошизомеры-распознают одинаково,но режут по разному.

Для все классов характерна зависимость от магния,но 1,3,4-зависят от атф и S-аденозилметионин.

Метилазы: Сайты узнавания в бактериальной ДНК модифицируются добавлением к ним метальной группы (—СНЗ) в процессе метилирования, который выполняется ферментами, называемыми метилазами. Метилирование не позволяет ферментам рестрикции разрезать геном в сайтах рестрикции. А вот геномы вирусов, у которых сайты рестрикции не модифицированы, могут быть разрезаны ферментами рестрикции и разрушены. Совокупность указанных процессов называется системой рестрикции и модификации.

Лигазы

В 1961 г. Мезельсон и Вейгл на примере фага l показали, что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединение молекул ДНК. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК. В 1967 году такой фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.

Иными словами, ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репарации ДНК, в процессах репликации - при удвоении цепи ДНК.

Существует 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в кофакторах и способу действия. ДНК-лигаза E. coli в качестве кофактора использует дифосфопиридиннуклеотид, а лигаза фага Т4 - АТФ в присутствии Mg2+. Лигаза фага Т4 более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она используется чаще.