Вопрос №23: организация плазмид rcr-типа.

внехромосомные генетические элементы, репликация которых осуществляется в соответствии с механизмом«катящегося кольца» (rolling circle replication или RCR-тип репликации). Отличительной особенностью является образование при репликации промежуточных структур, напоминающих греческую букву сигма (σ). Большинство плазмид RCR-типа характеризуются небольшими размерами (от 1,3 до 10 kb) и представляют собой молекулы ДНК, для репликации которых необходимо присутствие функциональных единиц, обеспечивающих инициацию синтеза ведущей цепи (dso-сайт и rep-ген), а также локусов, регулирующих число копий плазмид. В состав RCR-плазмид входят также сайт (либо сайты) инициации синтеза запаздывающей цепи (sso-сайт), который у ряда плазмид представлен несколькими последовательностями. Кроме того, имеются гены, ответственные за мобилизационный либо за конъюгативный переносы (mob/tra), а также детерминанты антибиотикорезистентности. Проведенный функциональный анализ плазмид RCR-типа выявил ряд особенностей. В частности, было установлено, что в ряде случаев, генетические детерминанты, входящие в состав плазмидного репликона, транскрибируются в одном направлении, причем направление транскрипции rep-гена, обычно, совпадает с направлением процесса репликации (исключением является плазмида pSN2). Кроме того, к интересной особенности отдельных плазмид RCR-типа можно отнести локализацию сайта начала репликации ведущей цепи (dso-сайта) внутри rep-гена [163, 285]. Отмеченные особенности, по-видимому, зависят от регуляции процесса репликации, которая обеспечивает поддержание в клетке определенного числа плазмидных копий.

Dso-сайт: протяженность не превышает 100 п.н., в нем локализовано два сайта, один из которыхпредставляет высокоспецифическую последовательность (bind-сайт), с которой нековалентно связывается Rep-белок, а во втором (nick-сайт) происходит надрез нити плазмидной ДНК. Для дсо-сайта характерно присутствие прямых и инвертированных повторов.

Таким образом, dso-область представляет собой нуклеотидную последовательность, в которой происходит связывание Rep-белка (в области bind-сайта), разрезание плазмидной молекулы (в области nick- сайта) с образованием свободного 3'-ОН конца, необходимого для начала процесса репликации и, наконец, разрезание вновь синтезированной последовательности с восстановлением кольцевой структуры (в области nick-сайта). При этом в результате процесса терминации происходит присоединение небольшого фрагмента ДНК nick-сайта размером 10 п.н. к тирозиновому остатку Rep-белка, что приводит к его инактивации и неспособности участвовать в следующем раунде репликации.

Rep-белки: Белки инициации репликации плазмид RCR-типа принадлежат к классу ферментов, осуществляющих локальное расплетение и разрыв фосфодиэфирных связей в молекуле плазмидной ДНК в области dso-сайта с образованием свободного 3'-OH конца, который служит затравкой для синтеза ведущей нити. также необходима для терминации репликации ведущей нити, когда осуществляется её разрыв c последующим восстановлением кольцевой структуры. В молекулах Rep- белков выявляется несколько консервативных аминокислотных последовательностей, обнаруживающих явную гомологию с последовательностями, имеющимися в Tra/Mob белках.

Sso-сайт: Синтез запаздывающей цепи инициируется в sso-сайте, отсутствие которого не приводит к остановке репликации плазмид RCR-типа, однако является причиной повышения нестабильности плазмидных репликонов и уменьшения числа их копий. Последовательность sso-сайта организована таким образом, что обеспечивают формирование вторичных структур в виде «шпилек». sso-сайт плазмид, принадлежащих к одной классификационной группе, представлены различными последовательностями ДНК и не содержат гомологичных участков, в то время как плазмиды, входящие в состав разных семейств могут обладать сходными типами sso-сайтов. Указанные последовательности локализованы, как правило, на небольшом расстоянии от dso-сайтов и характеризуются функциональной активностью только в однонитевых молекулах ДНК, образующихся после синтеза ведущей нити. В зависимости от особенностей вторичной структуры выделяют несколько типов sso-сайтов: ssoA, ssoU, ssoT, ssoW.

ВОПРОС №24: ОРГАНИЗАЦИЯ ФАГА λ.

В зрелых вирионах фага λ ДНК находится в виде двухцепочечной линейной молекулы раз­мером 48 502 пн. На концах молекулы ДНК имеются взаимокомплементарные GC-обогащенные одноцепочечные концы длиной 12 нук­леотидов (обозначаются как cosR и cosL). Сразу после попадания в клетку фаговая ДНК циклизуется по этим концам и функционирует в клет­ке в кольцевой форме. Район ковалентно заши­тых cosR и cosL называется cos-сайтом. Фаг λ является умеренным фагом, т. е. в зависимости от условий может развиваться в клетке либо по литическому, либо по лизогенному пути.

При литическом развитии происходит лизис клеток и образуются инфекционные фаговые частицы, при лизогенном молекула ДНК фага λ интегрируется в бактериальную хромосому преимущественно в одно место между генами gal и bio и находится в так называемом состоя­нии профага.

Геном фага λ можно разделить на три основ­ные части. Левая часть включает все гены (от Nu1 до J), белковые продукты которых необходимы для формирования капсидов и упа­ковки в них молекул фаговой ДНК. Централь­ная часть, расположенная между генами J и N, область гено­ма содержащая гены, участвующие в общей ре­комбинации фага (redα, и redβ), сайтспецифической интеграции ДНК фага в бактериальную хромосому (int) и исключении профага из хро­мосомы (xis). Сайтспецифические рекомбинационные события происходят по особым участ­кам на ДНК фага (att) и бактериальной хромо­сомы. Правая часть генома фага λ содержит все остальные контролирующие элементы, к кото­рым, в частности, относятся гены, необходимые для репликации фаговой ДНК (О и Р) и для лизиса клеток (S и R).

Существенные для литического развития фага гены транскрибируются с трех основных промоторов: pl, Pr и pr’. При развитии по лизогенному пути репрессор фага λ (продукт гена cl) связывается с операторами ol и or, предотвращая транскрипцию с рl и pr. При литическом развитии фага транскрипция идет с рl влево через ген N и с pr вправо через ген cro. В отсутствие продукта гена N транс­крипция в значительной степени терминирует­ся сразу после этих генов на участках tL и tRi. Второй терминирующий участок tR2 полностью предотвращает дальнейшую транскрипцию с промотора pr. Продукт гена N осуществляет свою функцию положительного регулятора через взаимодействие с РНК-полимеразой клетки, в результате чего такой модифицированный фермент способен преодолевать сигналы терминации транскрипции на фаговой ДНК. Бел­ковый продукт гена его имеет функции антирепрессора, и когда в клетке достаточно высока его концентрация, происходит дерепрессия транскрипции с pl и pr. В присутствии белка N транскрипция с pl идет до b -области, а с промо­тора pr — через гены О, Р и Q. Продукт по­следнего гена необходим для транскрипции поздних генов фага λ с Q-зависимого промотора Pr’. Так как при инфекции ДНК фага циклизуется, транскрипция с pr’ идет через гены S, R, А вплоть до гена J.

В клетке фаговая ДНК в результате репликации находится в конкатемерной форме, т. е. на одной гигантской моле­куле ДНК последовательно расположено не­сколько полных фаговых геномов. С cos -сайтами на этой ДНК связываются фаговые белки Nul и А. Эти белки обеспечивают нарезание фаговой ДНК в cos-сайтах с образованием од- ноцепочечных липких концов (co.sR и cosL) и упаковку фаговых геномов в преголовку. В ре­зультате формируется головка фага, которая, со­единяясь с хвостовым отростком, образует зре­лую фаговую частицу. Белковые продукты ге­нов RviS обеспечивают лизис клеточной стен­ки, в результате чего происходит выход в среду фагового потомства.

На ДНК фага λ имеется пять мест расщеп­ления рестриктазой ЕсоR1, причем три из них (sr\X 1 -.srlA3) находятся в области генов, несущественных для литического разви­тия фага. Для рестриктазы Hindlll на ДНК бак­териофага λ имеется шесть мест действия, и пять из них (shrdl - shnXS) — в области несу­щественных генов.

ВОПРОС №25.Векторы внедрения и векторы замещения на основе фага λ.

Наиболее часто используются фаговые векторы, полу-

ченные на основе умеренного фага λ. Молекула ДНК фага λ, состоящая из 48 502 пар нуклеотидов, включает область начала репликации, а также гены, кодирующие структурные вирусные белки, и ферменты, необходимые для репликации ДНК, лизиса инфицированных клеток и установления лизогении. Приблизительно 30% генома представлено областью, необязательной для литической инфекции. Этот участок содержит гены, необходимые для установления лиэогеиного состояния. Успешная упаковка ДНК «Jwra). в вирионы происходит в том случае, если ее длина больше 38 ООО пар нуклео-

тидов, но меньше 52 ООО пар. Поэтому существенно, чтобы у всех векторов, сконструированных на основе ДНК фага >.,вся необязательная область или ее часть была замещена фрагментом соответствующей длины. Как правило, мно-

гие или даже все гены, нужные для лизогении, удаляются, поэтому инфицирование Е. coli рекомбинантным вектором всегда сопровождается лизисом клетки-хозяина. λ -векгоры, пригодные для встраивания фрагментов чу-

жеродной ДНК путем замещения необязательной части генома без нарушения существенных областей, были получены из генома дикого типа с помощью мутаций и рекомбинациии in vivo и in vitro.

Геном фага λ во время жизненного цикла может находиться в четырех разных формах. В фаговой частице ДНК находится в линейной форме. Линейная ДНК характеризуется наличием одноцеиочечных выступов длиной 12

нуклеотидов, которые способны к взаимному спариванию. В инфицированных клетках Е. coli геном фага к замыкается в кольцо и сшивается под действием ДНК-лигазы. Места спаривания «липких» концов, как известно, получили название сов-сайтов. Образование кольцевой формы фиговой ДНК является необходимым для ее репликации. Более того, она служит предшественником при сайтспецифической интеграции ДНК фага в геном хозяина.

В интегрированном состоянии геном <J>ara λ снова становитсяся линейным. Наконец, в процессе репликации ДНК фага к по типу «катящегося кольца» образуются длинные конкатемеры, включающие многие копии генома к, кото-

рые впоследствии разрезаются по соя-сайтам с образовани-

ем зрелых фаговых ДНК.

λ -всктор короче генома фага X дикого типа более чем на 10 ООО пар нуклеотн-

дов. Небольшая необязательная область вблизи участка, обозначаемого как 43 ООО пар нуклеотидов. и часть центральной необязательной области в

векторе отсутствуют. При этом все гены, необходимые для литической инфекции, остаются интактными и молекула имеет размер, достаточный для упаковки в частицы бактернсиЗми п. Из пяти исходных сайтов для Eco RI сохранены только два и они расположены по обе стороны от оставшейся укороченной необязательной области. В результате эндонуклеолитического расщепления вектора образуются три фрагмента ДНК, один из которых соответствует левой части генома, второй - правой, а третий – необязательной центральной области.

Три фрагмента легко выделить, поскольку они существенно различаются по размерам. Для получения рекомбинантиой молекулы два очищенных концевых фрагмент смешивают с фрагментом-вставкой, отжигают и лигируют. Встраиваемый фрагмент должен иметь соответствующие «липкие» концы и размер от 5000 до 17 ООО пар оснований для последующей успешной упаковки рекомбинанта в вирионы. Следует отметить, что во время отжига и лигирования фрагменты могут соединяться двумя способами. Встраиваемая ДНК соединяется с двумя концевыми фрагментами в любой из двух ориентаций с помощью «липких» концов, а концевые фрагменты, в свою очередь. соединяются друг с другом с помощью одноцепочечных 12-нуклеотидных выступов. Таким образом, продуктом конструирования является конкатемер, обладающий специфическими cos-сайтами и пригодный для упаковки в зрелые фаговые частицы. ДНК фага X дикого типа или рекомбинактная ДНК упаковываются in vitro, если смешать при определенных условиях конкатемерную ДНК, предварительно сформированные пустые головки и хвостовые отростки фага и терминазу, кодируемую геномом фага. Головки взаимодействуют с комплексом, состоящим из конкатемерной λ -ДНК и терминалы, которая специфически связывается с ДНК вблизи сов-сайта. ДНК втягивается в головку, начиная с левого конца конкатемера, и полноразмерный линейный геном фага λ образуется в результате эндонуклео-литичсского расщепления в со$-сайтах, катализируемою терминазой