Вопрос №31. Организация т-днк и VIr-локуса. Ti-плазмид A. Tumefaciens.

Т-ДНК ограничены несовершенными прямыми повторами, состоящими из 25 п.н. Для переноса Т-ДНК важен только его правый повтор; делеция левого повтора ведет к переносу всей плаз­миды. Признак онкогенности обеспечивается двумя локусами: one, располагающимся в Т-ДНК и содержащим гены онкогенности, а также vir, отвечающим за перенос Т-ДНК в растительные клетки. Локусы vir у этих плазмид физически гомологичны и взаимозаме­няемы. Они включают около 25 генов, организованных в 7 опе­ронов (см. обзор Winans, 1992). Гены virA и virG экспрессируются конститутивно. Белок-сенсор VirA, интегрированный во внешнюю мембрану клеток, улавливает ацетосирингон и родственные фе- нольные производные, которые испускаются поврежденным рас­тением, и передает об этом сигнал цитоплазматическому белку VirG путем его фосфорилирования (рис. 3.14,6). Активированный белок VirG является позитивным регулятором транскрипции дру­гих v/V-генов. Связываясь с их промоторами, он индуцирует их экспрессию. Оперон virB, состоящий из 11 генов, детерминирует образование трансмембранного мостика (поры) между бактериаль­ной и растительной клетками. Далее эстафету принимают белки VirDl и VirD2, которые вырезают нить Т-ДНК с правым 5'-концом, делая ники в прямых концевых повторах; вытесняе­мая нить покрывается при этом SSB (single-strand binding) — бел­ком VirE2. Белок VirD2 ковалентно связывается с 5'-концом вы­тесненной нити и направляет ее через пору в растительное ядро. Конечно, и в растительной, и в бактериальной клетках восстанав­ливается дуплексная форма Т-ДНК.

В трансформированных растительных клетках Т-ДНК актив­но транскрибируется. мРНК Т-ДНК в растительных клетках уст­роены аналогично эукариотическим мРНК, т. е. на их 5'-концах находится 7-метилгуанозин, а на З'-концах — сайты полиадени- лирования ААУАА и полиадениловые цепочки. "Эукариотичес- кой" особенностью транскрипционного механизма Т-ДНК явля­ется и отсутствие в ней оперонов, в то время как в других частях Ti-плазмид опероны есть. Это пока единственный обнаруженный в природных условиях пример функционирования прокариоти- ческой нуклеотидной последовательности в эукариотических орга­низмах. Следует полагать, что функциональная часть Т-ДНК за исключением механизма переноса эволюционно происходит из растений.

Строение Т-ДНК и ее роль в образовании корончатых галлов у растений рассматриваются в гл. 12.

Способностью трансформировать клетки двудольных расте­ний обладают также некоторые плазмидосодержащие штаммы A. risogenes. У растений, зараженных этими бактериями, провоци­руется образование ткани, которая получила название косматого корня. Поэтому плазмиды, вызывающие этот эффект, называют Ri-плазмидами (root-inducing). Генетические карты Ri-плазмид схожи с таковыми Ti-плазмид. Оба типа плазмид физически го­мологичны в области vir, т.е. эволюционная близость их несом­ненна. Инфекционной частью Ri-плазмид также является Т-ДНК.

***

Трансформация растений Ti-плазмидой из Agrobacterium tumefaciens

Грамотрицательная почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens — фитопатоген, который в процессе своего жизненного цикла трансфор­мирует клетки растений. Эта трансформация приводит к образованию корончатого галла — опухоли, нарушающей нормальный рост расте­ния (рис. 17.1). Этой болезни, имеющей серьез­ные агрономические последствия, подвержены только двудольные растения, в частности вино­град, косточковые фруктовые деревья, розы.

Образование корончатого галла начинается с проникновения, интеграции в геном раститель­ных клеток и экспрессии специфического сег­мента бактериальной плазмидной ДНК — так называемой Т-ДНК (от англ. transferred DNA). Т-ДНК — это часть плазмиды, индуцирующей раз­витие опухоли (tumor-inducing plasmid, Ti-плазми- ды); ее несут большинство штаммов A. tumefaciens.

Длина Т-ДНК варьирует от 12 до 24 т. п. н. в за­висимости от штамма. Штаммы A. tumefaciens, не содержащие Ti-плазмиды, не способны индуци­ровать развитие корончатого галла.

Инфекционный процесс начинается с при­крепления A. tumefaciens к клеткам растения в месте повреждения, часто у основания стебля (у корневой шейки). Ранее предполагалось, что A. tumefaciens заражает именно поврежденные рас­тения вследствие разрушения клеточной стенки и устранения физического барьера, затрудняю­щего проникновение бактерий в клетку. Однако сейчас считается, что все дело в специфических фенольных соединениях, ацетосирингоне и гид- роксиацетосирингоне (рис. 17.2), которые выде­ляет поврежденное растение. Эти соединения сходны с некоторыми продуктами основного пути синтеза у растений вторичных метаболи­тов, таких как лигнины и флавоноиды. Ацетоси- рингон и гидроксиацетосирингон активируют гены вирулентности (v/r), которые локализова­ны в участке Ti-плазмиды длиной 35 т. п. н., на­ходящемся за пределами Т-ДНК. Продукты vir- генов необходимы для транспорта и интеграции Т-ДНК (рис. 17.3) в геном растительной клетки. Существуют по меньшей мере семь разных v/r- генов.

После присоединения A. tumefaciens, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке и актива­ции vir-генов Т-ДНК транспортируется в клет­ку, по-видимому, с помощью механизма, анало­гичного механизму переноса плазмидной ДНК из донорной клетки в реципиентную в процессе конъюгации. При этом Т-ДНК находится в од- ноцепочечной форме, и именно в такой форме она встраивается в хромосомную ДНК растения.

Переход Т-ДНК в одноцепочечную форму начинается с внесения в нее разрывов по обеим фланкирующим ее последовательностям. При этом правая фланкирующая последовательность оказывается на 5'-конце одноиепочечной Т- ДНК, а левая — на 3'-конце. Предполагается, что интеграция Т-ДНК в геном растения зави­сит от специфических последовательностей, ло­кализованных в правой фланкирующей после­довательности, которая содержит повтор длиной 25 н. н. Аналогичный повтор присутст­вует и в левой последовательности, однако, как показывает делеционный мутагенез, она не при­нимает участия в интеграции.

Большинство генов Т-ДНК активируются толь­ко после ее встраивания в геном растения. Их про­дукты и вызывают образование корончатого галла. Гены шаМ и iaaH, известные также как tmsl и tms2 соответственно, кодируют ферменты, принимаю­щие участие в синтезе растительного гормона аук­сина (индолилуксусной кислоты). Ген юаМ коди­рует фермент триптофан-2-монооксигеназу, которая катализирует превращение триптофана в индолил-З-ацетамид, а ген iaaH — ферме! п ин­дол ил - 3-а цета м идгид рол азу, катализирующую об­разование индолилуксусной кислоты из ицдолил- 3-ацетамида (рис. 17.4, А). Кроме того, Т-ДНК несет ген tmr (известный также как ген tip), коди­рующий изопентилтрансферазу — фермент, кото­рый катализирует присоединение к 5'-AMP изо- преноилной боковой цепи с образованием цитокининов изопентениладенина и изопенте- ниладенозинмонофосфата. При гидроксилировании этих соединений раститель­ными ферментами образуются цитокинины транезеатин и транерибозилзеатин соответствен­но. И ауксин, и цитокинины регулируют рост и развитие растительной клетки, но, присутствуя в избытке, могут вызывать у растений образование опухолей, таких как корончатый галл.

Кроме генов ауксина и цитокинина, Т-ДНК каждой специфической Ti-плазмиды содержит ген, детерминирующий синтез соединения из класса опинов. Опины — это уникальные продук­ты конденсации амино- и кетокислот или ами­нокислот и Сахаров. Например, при конденса­ции аргинина и пировиноградной кислоты образуется октопин, аргинина и а-кетоглута- ральдегида — нопалин, а бициклического произ­водного глутаминовой кислоты и сахара — агро- пин (рис. 17.5). Опины синтезируются в корончатом галле, а затем секретируются. Они могут использоваться как источник углерода (а иногда и как источник азота) любой A. tumefa­ciens, которая несет в Ti-плазмиде ген(ы) ката­болизма соответствующего опина (рис. 17.3), локализованные вне Т-ДНК. Большинство дру­гих исследованных почвенных микроорганиз­м мов не способны использовать онины как ис­точник углерода. Таким образом, в процессе эволюции выработался уникальный набор ме­ханизмов, посредством которых каждый штамм A. tumefaciens генетически трансформи­рует растительные клетки в «биологические фабрики» по производству соединений углеро­да, использовать которые могут только сами эти бактерии.

ВОПРОС №32. Механизм переноса Т-ДНК Ti-плазмид A. tumefaciens .

А. tumefaciens являются грамотрицательны- ми почвенными бактериями. Они существуют в ризосфере растений и у двудольных способны вызвать заболевание, называемое корончатым галлом (от англ. crown). В природе инфекцион­ный процесс, обусловленный вирулентными агробактериями,

начинается при повреждении растения и ведет к образованию опухолевых разрастаний в районе соединения стебля и кор­ня. Экспериментально установлено, что галлы могут формироваться также в любом месте по­вреждения растения при попадании в него агро- бактерий.

Патогенность A. tumefaciens для растений Э. Смит и К. Таунсенд выявили в 1907 г. В 1940-х гг. была выдвинута гипотеза о том, что растительные клетки трансформируются в ре­зультате того, что бактерия вводит в них некий агент, индуцирующий опухоль.

Клетки корончатых галлов во многих отно­шениях напоминают раковые клетки животных. Они приобретают способность к неограничен­ному нерегулируемому росту. Когда клетки ко рончатых галлов культивируют in vitro, они растут в отсутствие специальных гормонов, ко­торые необходимы при культивировании нор­мальных растительных клеток. Более того, клетки корончатых галлов продолжают сохра­нять эти свойства (трансформированный фено­тип), даже если убить агробактерии антибиоти­ками. Изучение природы индуктора опухолей A. tumefaciens позволило установить в 1974 г., что собственно опухолеродным агентом у этой бактерии является плазмида Ti (от англ. tumor inducing), размер шторой обычно составляет 200-250 тпн (рис. 19.1).

М. Чилтон с соавторами в 1977 г. обнаружи­ли, что плазмида Ti содержит так называемую Т-ДНК (transferred DNA), размер которой в раз­ных плазмидах варьирует от 10 до 30 тпн. Ti-плазмиды могут содержать как единичные, так и множественные копии Т-ДНК. Т-ДНК, прежде всего за счет активности примерно 35 ге­нов вирулентности vir, расположенных на плаз- миде И, способна передаваться в растительную клетку с последующей встройкой в хромосомы ядра. Т-ДНК ограничена с обеих сторон несо­вершенными прямыми повторами длиной 25 пн (рис. 19.2), называемыми правой и левой грани­цами (right и left borders, RB и LB). Несмотря на то, что RB и LB схожи по последовательности нуклеотидов, используются они по-разному. Де­ления правой границы приводит к прекращению переноса Т-ДНК, тогда как делеция левой грани­цы практически не влияет на этот процесс.

Т-ДНК кодирует ферменты синтеза фито- гормонов, индуцирующих опухолевое разрас­тание трансформированных тканей растения, а также ферменты синтеза необычных амино­кислот и Сахаров (опинов). Тип опина, синтези­руемого в опухоли (например, нопалин, окто- пин, агроцинопин, манопин и атропин), зависит от штамма агробактерий, вызывающего его об­разование. Опины, образующиеся из аргини­на — октопин и нопалин,—легче всего обнару­жить в ткани корончатых галлов. В соответст­вии с этим многие широко распространенные штаммы A. tumefaciens классифицируют как штаммы октопинового или нопалинового типа. Штаммы агробактерий, вызывающие образова ние опухолей растений, способны избиратель­но катаболизировать опины, синтез которых они индуцируют, и использовать их в качестве источника углерода и азота.

Гены ферментов биосинтеза гормонов и опинов, кодируемых Т-ДНК, хотя и находятся в бактерии, эволюционно адаптированы для экспрессии только в растительных клетках. Та­кие особенности агробактерии позволяют на­звать ее природным генным инженером.

Гены, определяющие присоединение агро- бактерий к растительной клетке и образование целлюлозных фибрилл, расположены как в Т-ДНК, так и на бактериальной хромосоме. Исследования механизма переноса Т-ДНК из агробактерий в клетку растения показали, что вирулентность контролируется на уровне транскрипции генов vir. При повреждении из растительной ткани выделяется сок с кислой реакцией (рН 5,0-5,8) и высокой концентраци­ей различных фенольных соединений, таких как лигнин и предшественники флавоноидов. Эти условия специфически стимулируют экс­прессию генов vir агробактерий. Наиболее эф­фективным индуктором vir является моноцик­лическое производное фенола ацетосирингон, с которым взаимодействует продукт гена v/rA, передавая сигнал внутрь клетки (рис. 19.3). Это приводит к активации продукта гена virG, что в свою очередь активирует остальные гены ви­рулентности. Белок VirD2 в комплексе с белка­ми VirCl и VirDl вносит одноцепочечные раз­рывы в нуклеотидные последовательности пра­вой и левой границ Т-ДНК (рис. 19.4). Синтези­руется новая цепь Т-ДНК, а старая с присо­единенным к 5'-концу VirD2 вытесняется (рис. 19.5). Процесс повторяется, и в клетке на­капливается одноцепочечная Т-ДНК, готовая к переносу. Затем комплекс Т-ДНК с белками VirD2 и VirE2 направленно (от правой границы к левой) переносится в клетку растения с по­мощью процесса, сходного с бактериальной конъюгацией (см. рис. 19.3). Перенос происхо­дит через пили, образованные полипептидом VirD4 и белковыми продуктами оперона v/rB, а затем через канал в клеточной мембране рас­тения, сформированный белком VirE2. Проник­новение Т-ДНК в ядро растительной клетки опо­средовано полипептидами VirD2 и VirE2. Эти же белки обеспечивают стабильную встройку пере­несенной ДНК в геном растения. Сайты инсер- ции Т-ДНК случайны, хотя ряд авторов отме­чают преимущественное внедрение Т-ДНК в транскрипционно активные области генома.

Экспериментально установлено, что после­довательность ДНК, заключенная между RB и LB, никак не влияет на эффективность перено­са Т-ДНК из агробактерии в клетку растения. Это позволило предположить, что Т-ДНК можно использовать для переноса чужеродных генов из A. tumefaciens в геном растительных клеток.