Вопрос №33. Принципы создания векторов на основе Ti-плазмид A. Tumefaciens.

Самый простой способ использования природ­ной способности Ti-плазмид к генетической трансформации растений предполагает встраи­вание интересующей исследователя нуклеотид- ной последовательности в Т-ДНК, а затем ис­пользование Ti-плазмид и A. tumefaciens для доставки и встраивания клонированного гена (генов) в геном компетентной растительной клетки. Однако, несмотря на то что Ti-плазмиды являются эффективными природными век­торами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для кло­нирования.

• Фитогормоны, синтезируемые трансформи­рованными клетками в культуре, подавляют регенерацию из этих клеток зрелого расте­ния, поэтому при конструировании векторов на основе Ti-плазм иды гены ауксина и цитокинина должны быть удалены.

• Ген опина несуществен для трансгенных рас­тений, но при его наличии может снижаться конечный выход биомассы, поскольку часть ресурсов расходуется на синтез опина. Сле­довательно, при создании векторов ген опи­на также должен быть удален.

• Ti-плазмиды имеют очень большой размер (от 200 до 800 т. п. н.), а для экспериментов с ре комби нантными ДНК нужны векторы меньшего размера, поэтому участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены.

• Ti-плазмиды не реплицируются в E. coli, что исключает работу с ре комби нантны­ми Ti-плазмидами в этих бактериях. Следо­вательно, при конструировании векторов на основе Ti-плазмид необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечиваю­щий их поддержание в Е. coli.

Несмотря на все эти сложности было сконст­руировано несколько векторов для растит. кл.. Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и имеют следу­ющие элементы.

• Селективный маркерный ген, например ген неомицинфосфотрансферазы, который обес­печивает устойчивость трансформированных растительных клеток к канамицину. Пос­кольку этот ген (как и многие другие маркер­ные гены, используемые при трансформации растений) по своей природе прокариотиче- ский, необходимо поставить его под конт­роль растительных (эукариотических) сигна­лов регуляции транскрипции, в том числе промотора и сигнала терминации полиаденилирования. Это обеспечит эффективную экспрессию гена в трансформир. рас­тит. кл..

• Сайт инициации репликации, который поз­воляет плазмиде реплицироваться в Е. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens.

• Правая фланкирующая последовательность Т-ДНК. Этот элемент абсолютно необходим для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений. Большинство же векторов содер­жат как правую, так и левую фланкирующие последовательности.

• Полилинкер для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.

Поскольку клонирующие векторы не содер­жат генов vir, они сами не способны обеспечи­вать транспорт и интефацию Т-ДНК в клетки растения-хозяина. Чтобы решить эту пробле­му, было разработано два подхода. В нервом случае используют бинарную векторную систе­му. Бинарный клонирующий век­тор содержит сайты инициации репликации и для Е. coli, и для A. tumefaciens, но не несет генов vir, т. е. это практически челночный вектор £. coli — A. tumefaciens. Все стадии клонирования прово дят в Е. coli, а затем вектор вводят в A. tumefaciens. Штамм-реципиент A. tumefaciens несет модифицированную неонкогенную («разору­женную») Ti-плазмиду; она содержит полный набор v//-генов, но из нее удалена часть (или вся) Т-ДНК (так что Т-ДНК не может быть транспортирована). В этой системе на неонкоген ной Ti-плазмиде синтезируются продукты v/r-генов, которые мобилизуют уча­сток Т-ДНК бинарного клонирующего векто­ра. Продуцируя белки, кодируемые v/7-генами, неонкогенная Ti-плазм и да выступает в роли помощника, способствуя встраиванию Т-ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромо­сомную ДНК растения.

Во втором случае используют коинтегративную векторную систему. Векторная ДНК рекомбиниру- ет в A. tumefaciens с «разоруженной» Ti-плазмшюй, Т-ДНК которой не несет опухалеродных генов, таким образом, что весь клонирующий вектор встраивается в неонкогенную Ti-плазмиду. Коинтегративный вектор и неонкоген­ная Ti-rui азм ида - помощи и к содержат гомоло­гичные последовательности, которые образуют сайт для гомологичной рекомбинации in vivo. Обычно эти последовательности расположены в Т-ДНК. После рекомбинации клонирующий век­тор становится частью неонкогенной Ti-ппазми- ды, которая содержит v/r-гены, необходимые для переноса Т-ДНК в растительную хозяйскую клетку

ВОПРОС №34: МЕТОДЫ ВВЕДЕНИЯ ВЕКТОРОВ В КЛЕТКИ РАСТЕНИЙ.

Первое для двудольных растений чаще всего - агробактриальная трансформация то есть обработка агробактериями каллусной культуры содержащей определенную векторную систему. Однадольные, есть успехи определенные, и модификации агробактериальной трансформации но как правило есть затруднение то есть агробактериальной трансформацией плохо вводятся т-днк в однодольные. Для тех растений для которых сложны эти приемы используется физический перенос ДНК. Физические методы разнообразны,, они включают в себя первое чаще всего бамбардировку микро частицами или баллистический метод,, (ну сдесь в принципе должна быть целевая т –днк и обязательно должна быть представлена вир область что бы происходило встраивание т – ДНК, Поэтому в введенной т-днк должна быть временная экспрессия вир генов.

Электропорация используется. Обработка полиэтилен гликолем. Перенос ДНК в составе липосом. Сейчас в последнее время наиболее используемый метод бомбардировки, при достаточной скорости частицы проникают в ядро либо могут быть трансформированы в хлоропласты или митохондрии.

+ взято из книги

Методы переноса генов в клетки различных организмов

Известны многочисленные методы, с помощью которых можно вне-дрить чужеродную ДНК в геном различных организмов.

В качестве реципиентов, в геном которых встраиваются чужеродные гены, используют клетки культуры, эмбриональные клетки млекопитаю-щих, некоторых растений, дрозофилы, пронуклеусы млекопитающих, у рас-тений – протопласты, изолированные клетки и ткани, микроспоры, незре-лые зиготические зародыши, проростки. Трансформация экзогенной ДНК может осуществляться либо в культуре клеток (in vitro = ex vivo), либо не-посредственно в организме (in vivo) с использованием следующих методов.

– Микроинъекция. С помощью тонких микроигл и микроманипулято-ра в клетку или прямо в ядро вводится векторная ДНК с включенным в нее трансгеном. С помощью микроинъекций осуществляется трансформация у дрозофилы, растений.

– Электропорация. Растительные протопласты или животные клетки обрабатывают импульсами электрического поля высокого напряжения, что обратимо увеличивает проницаемость биомембран. Через образующиеся на короткое время поры чужеродная ДНК проникает в клетку.

– Перенос ДНК в составе липосом. Липосомы – это искусственно соз-данные сферические образования, оболочка которых состоит из фосфоли-пидов. Липосомы, содержащие внутри трансформирующую ДНК, способны непосредственно сливаться с мембраной клетки или поглощаться клетками в результате процесса, подобного эндоцитозу. В клетке происходит разру-шение оболочки липосом и высвобождение рекДНК. Это один из методов, который используется для защиты трансформирующего генетического ма-териала от разрушительного действия нуклеаз, присутствующих вне клеток. Метод применяется для введения нуклеиновых кислот в культивируемые животные клетки, растительные протопласты.

ВОПРОС №35: ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ. ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ.ПРИМЕРЫ.

Трансгенные растения — это те растения, которым «пересажены» гены других организмов.

Принцип создания трансгенных растений и животных схожи. И в том, и в другом случае в ДНК искусственно вносятся чужеродные последовательности, которые встраивают, интегрируют генетическую информацию вида. Принципы создания т. е создание с помощью ti плазмиды.

Ti плазмиды используются в качестве векторов для растений.

Т-днк ti обладает свойствами делающими ее идеальным вектром для введения чужих генов в клетки растений. Во превых круг хозяев с которыми могут взаимодействовать агробактерии достаточно широк, все двудольные взаимодействуют с агробактериями и т-днк с тиай плазмиды может встраиваться в геном, но сейчас повторяю разработаны монипуляции которые позволяют вводить т-днк и в однодольные (в том числе и злаки) В двудольные в природе,, а в однодольные в лаборатории добились. Во вторых интегрированная в состав генома растения т-днк наследуется как простой даминантный признак в соответствии с законами менделя,, а гены которые входят в состав т-днк имеют собственные промоутеры (ген опина, цитокинина, оксина) под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в т-днк чужеродные гены. Вектора должны обладать след свойствами: 1) содержать все сигналы необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений т-днк (т.е это большая система белков которая обеспечивает ее перенос, поэтому должны обладать этими системами) 2) Содержать систему для экспрессии чужеродных генов в растениях то есть промоутерные участки; 3) Маркер селективный для отбора трансформированных клеток,,, 4)не должна т-днк содержать онко генов то есть генов которые подовляют дефиринцировку растительных клеток. Поскольку тиай плазмиды большие для конструкции векторов используют только т-днк (даже все что от нее там нада, самое главное должны быть на концах повторы которые будут узноваться системами вир белков и будет разрезаться в этих местах). Это т-днк вырезают с помощью рестриктаз и встраивают в стандартные вектора е коли,, то есть в вектора содержащие кол е репликон это может быть писи или пбр322. Дальше с помощью стандартных приемов удаляют практически все содержимое т-днк, за исключением концевых последовательностей. В т-днк встраивают определенный ген, получают гибрид писи с т-днк в который встроен ген, эту молекулу размножают. Эту плазмиду вносят в агробактерию тумефацинес которая содержит полную ti плазмиду. После попадания в клетку в результате обмена идентичными участками а именно за счет гомологичной рекомбинации между т сигментами нативной молекулы и сконструированной происходит встраивание т-днк (то есть происходит замещение исходной т –днк на чужеродную). Кол е репликон ее судьба либо исчезнуть т.к не может копироваться в этой системе либо встроиться. Таким образо в результате этого рекомбиционного обмена возникает тиай плазмида в которой т-днк представлена с чужим геном. Затем заражают растения агробактериями в которых имеется тиай с включенными чужеродными генами. В результате т-днк будет переносится в геном растительной клетки.

Примеры трансгенных растений. В настоящее время можно получить любое трансгенное растение и внедрение его в сельское хоз. В настоящее время в америке вся соя трансгенная. Когда начались создоваться трансген. Растен сразу было введено массу запретов, опасались. За прошедшие 20 лет трансгенные растения не приводят к изменению генома человека.

Повышение урожайности и изменение качества с/х продукции. Повышение урожайности должно быть связано с такими факторами как вредительство их (болезни, насекомые и т. д), соответственно для повышения урожайности следует бороться с этими факторами,но для повышения устойчивости растений к заболеваниям стратегически можно использовать два подхода: 1) вводить гены продукты которые действуют на внешних вредителей и второе это повышать устойчивость самого растения(поскольку у растений есть системы которые связаня с его устойчивостью к вредителям).

Гены таксинов например, многие растения сод гены определяющие синтез токсинов(гены бактериальные) - это край гены из бациллус перенгиенсис. То есть есть бактерии котор выделяют токсины,, гены этих токсинов и вводят в растения. Ну например хлопок, картофель (устойчивые к насекомым).. У устойчивых растений накапливается перикись водорода, салицировая кислота и фитоаликсины, повышенное содержание этих соединений усиливает защитные функции растений, поэтому генно инженерным путем добиваются увеличением выработки перикиси, салиц кисл в ответ на патоген. Второе направление: получение продуктов в виде антисмысловой РНК. Предположим у растения есть регуляторный участок и некий ген работу которого нужно уменьшить ну чтоб экспрессия шла меньше, для ослабления экспрессии вводят антисмысловую последовательность.

Например антисмысловая гена пиджи, это ген который контролирует синтез пигмента участвующего в разрушении пектина. Продукт этого ген а в растениях синтезируется в период созревания плодов (томаты), если увеличить его экспрессию то это приводит к тому что томаты становятся мягкими и сокращается их срок хранения,, отключения этого гена с помощью антсмысловой технологии позволило получить томаты плоды которых больше хранятся а сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Подход для регулирования созревания томатов еще был, в качестве мишени использовался EFE, продуктом которого является фермент участвующего в биосинтезе этилена, этилен является газообразным гормоном регулирующим созревание плодов.

Т-днк вставочный мутагенез. Встраиваясь в определенный ген он его выключает, это же выключение позволяет и облегчает путь клонирования генов растения, таким способом сейчас получено множество новых мутаций у растений и соответствующие гены клонированы. Ну например были получены растения к неспицифической устойчивостью к фитофторозу а потом они были клонированы.

Есть два пути введения чужих генов это отдаленная гибридизация которая имеет очень много сложностей то есть селекция когда вводится дикий ген путем гибридизации, либо трансгенные растения (можно ввести все что угодно, технология позволяет, можно получить любой гибрид).