В. Вирусы и токсины - ингибиторы матричных синтезов в эукариотических клетках

Вирусы

Генетический материал вирусов представлен молекулой ДНК или РНК. Он, как правило, невелик и содержит информацию лишь о некоторых специфических белках и ферментах, необходимых для репродукции вируса (например, вирусов оспы, гриппа, полиомиелита, гепатита). Вскоре после заражения с высокой скоростью начинается синтез вирусных ДНК, РНК и белков с использованием ферментов и белков, субстратов и источников энергии клетки хозяина. При этом в инфицированных клетках прекращается синтез нуклеиновых кислот и белков, свойственных организму хозяина. Репродукция вирусных частиц идёт вплоть до гибели заражённой клетки.

Токсины

Причиной гибели людей при отравлении бледной поганкой Amanita phalloides является токсин - α -аманитин, который содержится в теле гриба и вызывает необратимую дисфункцию печени и почек. Высокая токсичность этого соединения для человека связана с тем, что оно ингибирует эукариотические РНК-полиме-разы. Наибольшую чувствительность к яду обнаруживает РНК-полимераза II, катализирующая синтез мРНК. Для α-аманитина LD₅₀ (доза per os, при которой погибает 50% лиц, получивших токсин) составляет 0,1 мг/кг массы тела.

Чрезвычайно токсичен белок рицин, выделенный из клещевины обыкновенной. Он представляет собой N-гликозилазу, которая удаляет один остаток аденина из 28S рРНК большой субъединицы рибосомы и ингибирует синтез белка у эукариотов. Рицин - белковый компонент касторового масла, иногда используемого в качестве слабительного средства. Из-за высокой токсичности рицина лечение касторовым маслом проводят короткими курсами, так как длительное употребление может вызвать непрекращающийся понос, нарушение работы кишечника и даже гибель больного.

У человека развитие некоторых бактериальных инфекций сопровождается ингибированием матричных синтезов. Наиболее изученный пример - ингибирование синтеза белков в клетках слизистой оболочки зева и гортани энтеротоксином возбудителя дифтерии Corynebacterium diphteriae. Некоторые штаммы этого патогенного микроорганизма получают ген токсина от бактериального вируса, называемого β-фагом, который инфицирует бактерию и индуцирует синтез токсина - одноцепочечно-го белка с молекулярной массой 60 кД. В цитоплазме клеток хозяина под влиянием протеолитических ферментов токсин расщепляется на 2 фрагмента, один из которых является ферментом АДФ-рибозилтрансферазой. Этот фермент катализирует АДФ-рибозилирование и инактивацию фактора элонгации EF-2 по реакции:

EF-2 + NAD⁺ → АДФ-рибозил-ЕF-2 + никотинамид + Н⁺.

В условиях in vitro эта реакция обратима, но при рН и концентрации никотинамида, которые существуют в клетках, она становится необратимой. Модификация фактора EF-2 нарушает транслокацию рибосом, ведёт к прекращению биосинтеза белков в инфицированных клетках и к их гибели. С действием токсина связаны основные симптомы дифтерии.

Описаны и другие токсины бактериального и растительного происхождения, ингибирующие синтез и функциональную активность белков путём АДФ-рибозилирования или модификации рРНК.

Г. Интерфероны

Интерфероны - небольшие белки (гликопротеины), состоящие примерно из 160 аминокислотных остатков. Они сеьфетируются некоторыми клетками позвоночньж в ответ на заражение вирусами и препятствуют распространению вирусной инфекции. Этот класс белков синтезируется в исключительно малых количествах: от на-нограммов (1^-9г) до пикограммов (10^_12г), но является очень активным неспецифическим противовирусным агентом (10⁶-10⁹ единиц антивирусной активности на 1 мг белка). Это соответствует способности одной молекулы интерферона защищать от инфекции одну клетку.

Некоторые компоненты вирусных частиц (например, двухцепочечная РНК) индуцируют синтез по крайней мере 3 типов интерферонов. У человека имеются 14 генов, кодирующих α-интерфероны, которые продуцируются В-лимфоцитами и макрофагами, 5 генов β-интерферонов, обеспечивающих образование соответствующих белков фибробластами, и 1 ген γ-интерферона, экспрессия которого идёт в Т-лимфоцитах.

Связываясь с рецепторами на плазматической мембране заражённых клеток, эти белки, подобно белковым гормонам, стимулируют синтез ферментов, способных разрушать мРНК вирусов и прекращать синтез белков на рибосомах, препятствуя тем самым экспрессии вирусных генов в клетках эукариотов.

Исследование механизма действия интерферонов показало, что они:

• ингибируют синтез белков, необходимых для репликации вирусов;
• стимулируют синтез фермента олигонуклеотидполимеразы, катализирующего образование небольших количеств коротких олигоаденилатов: 2',5'-олиго (А). Эти олигонуклеотиды являются активаторами рибонуклеазы - фермента, расщепляющего матричные и рибосом-ныеРНК;
• стимулируют синтез протеинкиназы, которая фосфорилирует и, тем самым, инактивирует фактор инициации eIF2:

eIF2 + АТФ → eIF2-OPO₃H₂ + АДФ.

В результате синтез всех белков в инфицированных клетках прекращается. Клетки погибают, но вместе с ними останавливается размножение вирусов, и начинается выздоровление. Таким образом, жертвуя небольшим количеством клеток, организм защищает себя от болезни.

В настоящее время интерфероны, полученные промышленным путём с использованием техники клонирования генов, широко используют при лечении обычной простуды, гриппа, полиомиелита, ветряной оспы, герпеса, вируса гепатита и других инфекций. Хорошие результаты показывает использование интерферонов в терапии некоторых видов злокачественных опухолей, главным образом, гемобластозов (см. раздел 15), хотя их роль в химиотерапии опухолей до настоящего времени остаётся малопонятной.

18. Адаптивная регуляция активности генов у про- и эукориотов. Теория оперона. Функционирование оперонов, регулируемых по принципу индукции и репрессии. Роль энхансеров и селенсоров, амплификации и перестройки генов, процессинга, транспорта из ядра в цитоплазму и изменение стабильности мРНК в регуляции синтеза белков у эукариотов – основа онтогенеза и специализации органов и тканей у многоклеточного организма. Синтез гемоглобина у человека на стадиях: эмбрион → плод → взрослый организм.

Организмы адаптируются к меняющимся условиям окружающей среды путём изменения экспрессии (скорости транскрипции) генов. Этот процесс, в деталях изученный на бактериях и вирусах, включает взаимодействие специфических белков с участками ДНК в непосредственной близости от стартового участка транскрипции. При этом может происходить включение или выключение транскрипции. Эукариотические клетки используют тот же самый принцип, хотя в регуляции реализуются и некоторые другие более сложные механизмы.

 

А. Регуляция активности генов у прокариотов. Теория оперона

Исследования на клетках Е. coli позволили установить, что у бактерий существуют ферменты 3 типов:

· конститутивные, присутствующие в клетках в постоянных количествах независимо от метаболического состояния организма (например, ферменты гликолиза);

· индуцируемые, их концентрация в обычных условиях мала, но может возрастать в 100Q раз и более, если, например, в среду культивирования клеток добавить субстрат такого фермента;

· репрессируемые, т.е. ферменты метаболических путей, синтез которых прекращается при добавлении в среду выращивания конечного продукта этих путей.

Теория оперона

На основании генетических исследований индукции β-галактозидазы, участвующей в клетках Е. coli, в гидролитическом расщеплении лактозы (рис. 4-46), Франсуа Жакоб и Жак Моно в 1961 г. сформулировали гипотезу оперона, которая объясняла механизм контроля синтеза белков у прокариотов.

В экспериментах гипотеза оперона получила полное подтверждение, а предложенный в ней тип регуляции стали называть контролем синтеза белка на уровне транскрипции, так как в этом случае изменение скорости синтеза белков осуществляется за счёт изменения скорости транскрипции генов, т.е. на стадии образования мРНК.

У Е. coli, как и у других прокариотов, ДНК не отделена от цитоплазмы ядерной оболочкой. В процессе транскрипции образуются первичные транскрипты, не содержащие нитронов, а мРНК лишены "кэпа" и поли-А-конца. Синтез белка начинается до того, как заканчивается синтез его матрицы, т.е. транскрипция и трансляция протекают почти одновременно. Исходя из размера генома (4×10⁶ пар нуклеотидов), каждая клетка Е. coli содержит информацию о нескольких тысячах белков. Но при нормальных условиях роста она синтезирует около 600-800 различных белков, а это означает, что многие гены не транскрибируются, т.е. неактивны. Гены белков, функции которых в метаболических процессах тесно связаны, часто в геноме группируются вместе в структурные единицы (опероны). Согласно теории Жакоба и Моно, оперонами называют участки молекулы ДНК, которые содержат информацию о группе функционально взаимосвязанных структурных белков, и регуляторную зону, контролирующую транскрипцию этих генов. Структурные гены оперона экспрессируются согласованно, либо все они транскрибируются, и тогда оперон активен, либо ни один из генов не "прочитывается", и тогда оперон неактивен. Когда оперон активен и все его гены транскрибируются, то синтезируется полицистронная мРНК, служащая матрицей для синтеза всех белков этого оперона. Транскрипция структурных генов зависит от способности РНК-полимеразы присоединяться к промотору, расположенному на 5'-конце оперона перед структурными генами.

Связывание РНК-полимеразы с промотором зависит от присутствия белка-репрессора на смежном с промотором участке, который называют "оператор". Белок-репрессор синтезируется в клетке с постоянной скоростью и имеет сродство к операторному участку. Структурно участки промотора и оператора частично перекрываются, поэтому присоединение белка-репрессора к оператору создаёт стерическое препятствие для присоединения РНК-полимеразы.

Большинство механизмов регуляции синтеза белков направлено на изменение скорости связывания РНК-полимеразы с промотором, влияя таким образом на этап инициации транскрипции. Гены, осуществляющие синтез регуяятор-ных' белков, могут быть удалены от оперона, транскрипцию которого они контролируют.