Депуринизация (апуринизация)

Таблица 4-2. Циклимы и циклинзависимые киназы, регулирующие прохождение клеточного цикла

Ошибки репликации

Точность репликации ДНК очень велика, но примерно один раз на 10⁵-10⁶ нуклеотидных остатков происходят ошибки спаривания, и тогда вместо пары нуклеотидов А-Т, G-С в дочернюю цепь ДНК оказываются включёнными нуклеотиды, некомплементарные нуклеотидам матричной цепи. Однако ДНК-полимеразы δ, ε способны после присоединения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК делать шаг назад (в направлении от 3'- к 5'- концу) и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной цепи ДНК. Этот процесс исправления ошибок спаривания (или коррекция) иногда не срабатывает, и тогда в ДНК по окончании репликации остаются некомплементарные пары, тем более, что ДНК-полимераза лишена корректирующего механизма и "ошибается" чаще, чем другие полимеразы.

При неправильном спаривании в первичной структуре дочерней цепи ДНК необычные основания не появляются, нарушена только ком-плементарность. Система репарации некомплементарных пар должна происходить только на дочерней цепи и производить замену некомплементарных оснований только в ней. Ферменты, участвующие в удалении неправильной пары нуклеотидов, распознают матричную цепь по наличию метилированных остатков аденина в последовательностях -GATC-. Пока основания нуклеотидных остатков в дочерней цепи неметилированы, ферменты должны успеть выявить ошибку репликации и устранить её.

Распознавание и удаление (первый этап) некомплементарного нуклеотида происходят при участии специальных белков mut S, mut L, mut H. Каждый из белков выполняет свою специфическую функцию. Mut S находит неправильную пару и связывается с этим фрагментом. Mut Н присоединяется к метилированному (по аденину) участку -GATC-, расположенному вблизи некомплементарной пары. Связующим между mut S и mut Н служит белок mut L, его присоединение завершает образование активного фермента. Формирование комплекса mut S, mut L, mut Н на участке, содержащем ошибку, способствует проявлению у белка mut Н эндонуклеазной активности. Ферментативный комплекс гидролизует фосфоэфирную связь в неметилированной цепи (рис. 4-21).

К свободным концам цепи присоединяется экзонуклеаза (второй этап). Отщепляя по одному нуклеотиду в направлении от 3'- к 5'- концу дочерней цепи, она устраняет участок, содержащий некомплементарную пару. Брешь застраивает ДНК-полимераза β (третий этап), соединение основного и вновь синтезированного участков цепи катализирует фермент ДНК-лигаза (четвёртый этап). Для успешного функционирования экзонуклеазы, ДНК-полимеразы р и ДНК-лигазы необходимо участие в репарации хеликазы и SSB-белков.

Депуринизация (апуринизация)

ДНК каждой клетки человека теряет за сутки около 5000 пуриновых остатков вследствие разрыва N-гликозидной связи между пурином и дезоксирибозой (рис. 4-22).

Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется участок, лишённый азотистых оснований, названный АП-сайтом (AP-site, или апуриновый сайт). Термин "АП-сайт" используют также в тех случаях, когда из ДНК выпадают пиримидиновые основания и образуются апиримидиновые сайты (от англ, apurinic-apyrimidinic site).

Этот тип повреждений устраняет фермент ДНК-инсертаза (от англ, insert - вставлять), который может присоединять к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом компле-ментарности. В этом случае нет необходимости разрезать цепь ДНК, вырезать неправильный нуклеотид и репарировать разрыв.

Дезаминирование

Реакции дезаминирования цитозина и превращение его в урацил (рис. 4-23), аденина в гипоксантин, гуанина в ксантин происходят значительно реже, чем депуринизация, и составляют 10 реакций на один геном в сутки.

Исправление этого вида спонтанного повреждения происходит в 5 этапов (рис. 4-24). В репарации принимает участие ДНК-N-гликозилаза, гидролизующая связи между аномальным основанием и дезоксирибозой (первый этап), в результате образуется АП-сайт, который распознаёт фермент АП-эндонуклеаза (второй этап). Как только в цепи ДНК возникает разрыв, в работу вступает ещё один

Рис. 4-21. Система репарации ошибок репликации. 1 - белок mut S "узнаёт" некомплементарную пару и присоединяется в этом участке ДНК; 2 - белки mut H взаимодействуют с метилированной по аденину последовательностью материнской цепи -GATC-; завершается формирование ферментативного комплекса после присоединения mut L; 3 - комплекс определяет вновь синтезированную цепь по отсутствию метилированного остатка аденина в последовательности -GATC- и разрывает её; 4 - экзонуклеаза удаляет фрагмент дочерней цепи ДНК, содержащий ошибку; 5 - ДНК-полимераза β по принципу комп-лементарности застраивает брешь; 6 - ДНК-лигаза З'-конец вновь синтезированного фрагмента соединяет с основной цепью и завершает репарацию ошибки.

фермент - АП-экзонуклеаза, который отщепляет от цепи дезоксирибозу, лишённую основания (третий этап). В цепи ДНК появляется брешь размером в один нуклеотид. Следующий фермент ДНК-полимераза р к З'-концу разорванной цепи присоединяет нуклеотид по принципу комплементарности (четвёртый этап). Чтобы соединить два свободных конца (3'-конец встроенного нуклеотида и 5'-конец основной цепи), требуется ещё один фермент - ДНК-лигаза (пятый этап).

Нерепарйруемо и поэтому опасно дезаминирование метилированного цитозина. Продукт его спонтанного дезамжнирования - тимин,

Рис. 4-22. Депуринизация - спонтанное удаление аденина или гуанина.

Рис. 4-23. Продукты спонтанного дезаминирования различных оснований ДНК. Все продукты дезаминирования (урацил, гипоксантин, ксантин) нехарактерны для состава ДНК и поэтому довольно легко распознаются ферментами репарации.

нормальное для ДНК основание, которое не распознаётся ДНК-N-гликозилазой.

Б. Индуцируемые повреждения

Индуцируемые повреждения возникают в ДНК в результате воздействия разнообразных мутагенных факторов как радиационной, так и химической природы.

Образование димеров пиримидиновых оснований

Под действием УФО двойная связь между С₅ и С₆ атомами углерода в составе пиримидиновых оснований (тимине и цитозине) может разрываться. Атомы углерода остаются связанными одной связью. Расстояние между параллельными плоскостями оснований полинуклеотидной цепи, в которых произошёл разрыв., равно примерно 3,4 . Это расстояние позволяет освободившимся валентностям между С-С атомами пиримидиновых оснований, расположенных последовательно в цепи ДНК, сформировать циклобутановое кольцо (рис. 4-25). В зависимости от того, какие основания соединены в димер, их называют димерами тимина, цитозина или ти-мин-цитозиновыми димерами.

Удаление пиримидиновых димеров происходит под действием фотолиазы Фермент расщепляет вновь образовавшиеся связи между соседними пиримидиновыми основаниями и восстанавливает нативную структуру. В фотолиазе есть участок, либо сам поглощающий фотоны (в синей части спектра), либо связывающийся с кофакторами, адсорбирующими свет. Таким образом, свет активирует фотолиазу, которая распознаёт димеры в облучённой ДНК, присоединяется к ним и разрывает возникшие между пиримидиновыми кольцами

Рис. 4-24. Репарация АП-сайтов с участием ДНК-М-гликозилазы и АП-экзонуклеазы.

связи. После этого фермент отделяется от ДНК.

Рис. 4-25. Димер тимина (циклобутановое кольцо).

окислению, восстановлению или связыванию основания с формамидными группировками. Репарация начинается с присоединения ДНК-N-гликозилазы к повреждённому основанию. Существует множество ДНК-М-гликозилаз, специфичных к разным модифицированным основаниям. Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между изменённым основанием и дезоксирибозой, это приводит к образованию АП-сайта в цепи ДНК (первый этап). Репарация АП-сайта может происходить или только при участии ДНК-инсертазы, которая присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности, или при участии всего комплекса ферментов, участвующих в репарации: АП-эндонуклеазы, АП-экзонуклеазы, ДНК-полимеразы β и ДНК-лигазы.

РНК-полимеразы

Биосинтез РНК осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. В ядрах эукариотов обнаружены 3 специализированные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I, синтезирующая пре-рРНК; РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК; РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК. РНК-полимеразы - олигомерные ферменты, состоящие из нескольких субъединиц - 2α, β, β', σ. Субъединица о (сигма) выполняет регуляторную функцию, это один из факторов инициации транскрипции, РНК-полимеразы I, II, III, узнающие разные промоторы, содержат разные по строению субъединицы σ.

А. Стадии транскрипции

В процессе транскрипции различают 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация

Активация промотора происходит с помощью большого белка - ТАТА-фактора, называемого так потому, что он взаимодействует со специфической последовательностью нуклеотидов промотора - ТАТААА- (ТАТА-бокс) (рис. 4-29).

Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Факторы инициации вызывают изменение кон-формации РНК-полимеразы и обеспечивают раскручивание примерно одного витка спирали ДНК, т.е. образуется транскрипционная вилка,

Рис. 4-27. Строение транскриптона.

Рис. 4-28. Транскрипция РНК на матричный цепи ДНК. Синтез РНК всегда происходит в направлении 5' → 3'.

Рис. 4-29. Строение промотора эукариотов. Промоторные элементы - специфические последовательности нуклеотидов, характерные для любого промотора, связывающего РНК-полимеразу. Первый промоторный элемент - последовательность АТАТАА- (ТАТА-бокс) отделён от сайта начала транскрипции приблизительно на 25 пар нуклеотидов (п.н.). На расстоянии примерно 40 (иногда до 120) п.н. от него располагается последовательность GGCCAATC- (СААТ-бокс).

в которой матрица доступна для инициации синтеза цепи РНК (рис. 4-30).

После того как синтезирован олигонуклеотид из 8-10 нуклеотидных остатков, σ-субъединица отделяется от РНК-полимеразы, а вместо неё к молекуле фермента присоединяются несколько факторов элонгации.

Элонгация

Факторы элонгации повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК. Синтез молекулы РНК идёт от 5'- к З'-концу комплементарно матричной цепи ДНК. На стадии элонгации, в области транскрипционной

вилки, одновременно разделены примерно 18 нуклеотидных пар ДНК. Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную спираль, около 12 пар нуклеотидных остатков, с матричной цепью ДНК. По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице в направлении от 3'- к 5'-концу впереди неё происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали ДНК.

Терминация

Раскручивание двойной спирали ДНК в области сайта терминации делает его доступным для фактора терминации. Завершается синтез РНК в

Рис. 4-30. Стадии транскрипции. 1 - присоединение ТАТА-фактора к промотору. Чтобы промотор был узнан РНК-полимера-зой, необходимо образование транскрипционного комплекса ТАТА-фактор/ТАТА-бокс (промотор). ТАТА-фактор остаётся связанным с ТАТА-боксом во время транскрипции, это облегчает использование промотора многими молекулами РНК-полимеразы; 2 - образование транскрипционной вилки; 3 - элонгация; 4.- терминация.

строго определенных участках матрицы - терминаторах (сайты терминации). Фактор терминации облегчает отделение первичного транскрипта (пре-мРНК), комплементарного матрице, и РНК-полимеразы от матрицы. РНК-полимераза может вступить в следующий цикл транскрипции после присоединения субъединицы σ.

Б. Ковалентная модификация (процессинг) матричной РНК

Первичные транскрипты мРНК, прежде чем будут использованы в ходе синтеза белка, подвергаются ряду ковалентных модификаций. Эти модификации необходимы для функционирования мРНК в качестве матрицы.

Модификация 5'-конца

Модификации пре-мРНК начинаются на стадии элонгации. Когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидных остатков, происходит кэпирование его 5'-конца. Осуществляет кэпирование гуанилилтрансфераза. Фермент гидролизует макроэргическую связь в молекуле ГТФ и присоединяет нуклеотиддифосфатный остаток 5'-фосфатной группой к 5'-концу синтезированного фрагмента РНК с образованием 5', 5'-фосфодиэфирной связи. Последующее метилирование остатка гуанина в составе ГТФ с образованием N₇-метилгуанозина завершает формирование кэпа (рис. 4-31).

Рис. 4-31. Ковалентная модификация концевых нуклеотидных остатков первичного транскрипта мРНК.

Модифицированный 5'-конец обеспечивает инициацию трансляции, удлиняет время жизни мРНК, защищая её от действия 5'-экзонуклеаз в цитоплазме. Кэпирование необходимо для инициации синтеза белка, так как инициирующие триплеты AUG, GUG распознаются рибосомой только если присутствует кэп. Наличие кэпа также необходимо для работы сложной ферментной системы, обеспечивающей удаление нитронов.

Модификация 3'-конца

3'-Конец большинства транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II, также подвергается модификации, при которой специальным ферментом полиА-полимеразой формируется полиА-последовательность (полиА-"хвост"), состоящая из 100-200 остатков аде-ниловой кислоты.

Сигналом к началу полиаденилирования является последовательность -AAUAAA- на растущей цепи РНК. Фермент полиА-полимераза, проявляя экзонуклеазную активность, разрывает 3'-фосфоэфирную связь после появления в цепи РНК специфической последовательности -AAUAAA-. К 3'-концу в точке разрыва полиА-полимераза наращивает по-лиА-"хвост", Наличие полиА-последовательности на 3'-конце облегчает выход мРНК из ядра и замедляет её гидролиз в цитоплазме.

Ферменты, осуществляющие кэширование и полиаденилирование, избирательно связываются с РНК-полимеразой II, и в отсутствие полимеразы неактивны.

Смысл кодонов

Смысл кодонов стал понятен в 60-х г. XX столетия, когда, используя бесклеточную систему синтеза белков (табл. 4-3) и синтетические полирибонуклеотиды с заданной последовательностью нуклеотидов в качестве матрицы, М. Ниренберг и Г. Маттеи синтезировали полипептиды определённого строения. Так, на матрице поли-У, состоящей только из остатков УМФ, был получен полифенилаланин, а на матрице поли-Ц - полипролин. Из этого следовало, что триплет -UUU кодирует Фен, а триплет -ССС - Про.

В последующих экспериментах использовали смешанные синтетические полирибонуклеотиды с известным составом. В результате этой работы удалось установить, что из 64 кодонов включение аминокислот в синтезирующуюся полипептидную цепь шифрует 61 триплет, а 3 остальных - UAA, UAG, UGA не кодируют включение в белок аминокислот и первоначально были названы бессмысленными, или нон-сенс-кодонами. Однако в дальнейшем было показано, что эти триплеты сигнализируют о завершении трансляции, и поэтому их стали называть терминирующими, или стоп-кодонами.

Кодоны мРНК и триплеты нуклеотидов в кодирующей нити ДНК с направлением от 5' к 3'-концу имеют одинаковую последовательность азотистых оснований, за исключением того, что в ДНК вместо урацила (U), характерного для мРНК, стоит тимин (Т).

Специфичность

Каждому кодону соответствует только одна определённая аминокислота. В этом смысле генетический код строго однозначен.

Таблица 4-3. Основные компоненты белоксинтезирующей системы

Необходимые компоненты	Функции
1. Аминокислоты	Субстраты для синтеза белков
2. тРНК	тРНК выполняют функцию адаптеров. Они акцепторным концом взаимодействуют с аминокислотами, а антикодоном - с кодоном мРНК.
3. Аминоацил-тРНК синтетазы	Каждая аа-тРНК-синтетаза катализирует реакцию специфического связывания одной из 20 аминокислот с соответствующей тРНК
4.мРНК	Матрица содержит линейную последовательность кодонов, определяющих первичную структуру белков
5. Рибосомы	Рибонуклеопротеиновые субклеточные структуры, являющиеся местом синтеза белков
6. АТФ, ГТФ	Источники энергии
7. Белковые факторы инициации, элонгации, терминации	Специфические внерибосомные белки, необходимые для процесса трансляции (12 факторов инициации: elF; 2 фактора элонгации: eEFl, eEF2, и факторы терминации: eRF)
8. Ионы магния	Кофактор, стабилизирующий структуру рибосом

Примечания: elF (eukaryotic initiation factors) - факторы инициации; eEF (eukaryotic elongation factors) - факторы элонгации; eRF (eukaryotic releasing factors) - факторы терминации.

Вырожденность

В мРНК и ДНК имеет смысл 61 триплет, каждый из которых кодирует включение в белок одной из 20 аминокислот. Из этого следует, что в информационных молекулах включение в белок одной и той же аминокислоты определяют несколько кодонов. Это свойство биологического кода получило название вырожденности.

У человека одним кодоном зашифрованы только 2 аминокислоты - Мет и Три, тогда как Лей, Сер и Apr - шестью кодонами, а Ала, Вал, Гли, Про, Тре - четырьмя кодонами (табл. 4-4).

Избыточность кодирующих последовательностей - ценнейшее свойство кода, так как она повышает устойчивость информационного потока к неблагоприятным воздействиям внешней и внутренней среды. При определении природы аминокислоты, которая должна быть включена в белок, третий нуклеотид в кодоне не имеет столь важного значения, как первые два. Как видно из табл. 4-4, для многих аминокислот замена нуклеотида в третьей позиции кодона не сказывается на его смысле.

Универсальность

До недавнего времени считалось, что код абсолютно универсален, т.е. смысл кодовых слов одинаков для всех изученных организмов: вирусов, бактерий, растений, земноводных, млекопитающих, включая человека. Однако позднее стало известно одно исключение, оказалось, что митохондриальная мРНК содержит 4 триплета, имеющих другое значение, чем в мРНК ядерного происхождения. Так, в мРНК митохондрий триплет UGA кодирует Три, AUA - Мет, а АСА и AGG прочитываются как дополнительные стоп-кодоны.

Таблица 4-4. Генетический код

Первое основание	Второе основание
	U	С	А	G
U	UUU Фен	UCU Cep	UAU Тир	UGU Цис
UUС Фен	UCC Сер	иАСТир	UGC Цис
UUА Лей	UCA Cep	UAA^*	UGA^*
UUG Лей	UCG Сер	UAG^*	UGG Apr
С	CUU Лей	CCU Про	CAU Гис	CGU Apr
CUC Лей	ССС Про	САС Гис	CGC Apr
CUA Лей	ССА Про	САА Глн	CGA Apr
CUG Лей	CCG Про	CAG Глн	CGG Apr
А	AUU Иле	ACU Tpe	AAU Асн	AGU Сер
AUC Иле	АСС Тре	ААС Асн	AGG Сер
AUA Мет	АСА Тре	ААА Лиз	AGA Apr
AUG Мет	ACG Тре	AAG Лиз	AGG Apr
G	GUU Ban	GCU Ала	GAU Асп	GGU Гли
GUC Вал	GCC Ала	GAC Асп	GGC Гли
GUА Вал	GСА Ала	GАА Глу	GGA Гли
GUG Вал	GСG Ала	GAG Глу	GGG Гли

Примечания: U - урацил; С - цитозин; А - аденин; G - гуанин; ^* - терминирующий кодон.

У эукариотов последовательности оснований в гене, колинеарные аминокислотной последовательности в белке, прерываются нитронами. Поэтому в эукариотических клетках аминокислотная последовательность белка колинеарна последовательности экзонов в гене или зрелой мРНК после посттранскригщионного удаления интронов.

Аминокислоты

Все 20 аминокислот, входящих в структуру белков организма человека, должны присутствовать в достаточном количестве. Это требование прежде всего относится к незаменимым (т.е. не синтезирующимся в организме) аминокислотам, так как недостаточное снабжение клетки хотя бы одной незаменимой аминокислотой приводит к снижению, а иногда и полной остановке синтеза белка на кодоне, требующем включения этой аминокислоты в белок.

мРНК. Содержит информацию о структуре синтезируемого белка и используется в качестве матрицы.

тРНК. У человека около 50 различных тРНК обеспечивают включение аминокислот в белок. тРНК называют " адапторные молекулы", так как к акцепторному концу этих молекул может быть присоединена определённая аминокислота, а с помощью антикодона они узнают специфический кодон на мРНК. В процессе синтеза белка на рибосоме связывание антикодонов тРНК с кодонами мРНК происходит по принципу комплементарности и антипараллельности.

Антикодон тРНК^Арг	(3')-G-С-С-(5')
Кодоны Apr:	(5')-C-G-G-(3')

Однако оказалось, что число тРНК для каждой аминокислоты не совпадает с числом кодирующих её кодонов в мРНК, и, следовательно, некоторые тРНК способны связываться больше чем с одним кодоном.

Исследование этого вопроса позволило установить следующее:

• первые два основания кодона и последние два основания антикодона образуют обычные прочные пары (гуанинцитозин и аденинурацил) и вносят наибольший вклад в специфичность декодирования;
• связывание третьего основания кодона с первым основанием антикодона происходит слабее, чем с первыми двумя, и это позволяет некоторым тРНК прочитывать больше чем один кодон.

Гипотеза, объясняющая характер кодонан-тикодонового взаимодействия, получила название "гипотезы качания" (т.е. третье основание большинства кодонов имеет определённую степень свободы при образовании пары с соответствующим антикодоном и как бы "качается").

Так, например, одна из аргининовых тРНК имеет антикодон 5'-I-C-G-3', который может узнавать 3 разных аргининовых кодона:

Антикодон	(3')-G-C-I-(5')	(3')-G-C-I-	(3')-G-C-I-
Кодоны	(3)-С-G-А-(3')	(5')-C-G-U-	(5')-C-G-C-

Инициация

Инициация трансляции представляет собой событие, в ходе которого происходит образование комплекса, включающего Мет-тРНК_i^Мет, мРНК и рибосому, где тРНК_i^Мет - инициирующая метиониновая тРНК (рис. 4-37). В этом процессе участвуют не менее 10 факторов инициации, которые обозначают как elF (от англ. eukaryotic initiation factors) с указанием номера и буквы. Первоначально 40S субъединица рибосомы соединяется с фактором инициации, который препятствует ее связыванию с 60S субъединицей, но стимулирует объединение с тройным комплексом, включающим Мет-тРНК_i^Мет, eIF-2 и ГТФ. Затем этот теперь уже более сложный комплекс связывается с 5'-концом мРНК при участии нескольких elF. Один из факторов инициации (eIF-4F) узнаёт и присоединяется к участку "кэп" на молекуле мРНК, поэтому он получил название кэпсвязывающего белка. Прикрепившись к мРНК, 40S субъединица начинает скользить по некодирующей части мРНК до тех пор, пока не достигнет инициирующего кодона AUG кодирующей нуклеотидной последовательности. Скольжение 40S субъединицы по мРНК сопровождается гидролизом АТФ, энергия которого затрачивается на преодоление участков спирализации в нетранслируемой части мРНК. В эукариотических клетках некодирующие участки мРНК имеют разную длину, но обычно от 40 до 80 нуклеотидов, хотя встречаются области с протяжённостью более 700 нуклеотидов.Достигнув начала кодирующей последовательности мРНК, 40S субъединица останавливается и связывается с другими факторами инициации, ускоряющими присоединение 60S субъединицы и образование 80S рибосомы за счёт гидролиза ГТФ до ГДФ и неорганического фосфата. При этом формируются А- и Р-центры рибосомы, причём в Р-центре оказывается AUG-кодон мРНК с присоединённым к нему Мет-тРНК_i^Мет.В клетках есть 2 различающиеся по структуре тРНК, узнающие кодон AUG. Инициирующий кодон узнаёт тРНК_i^Мет, а триплеты мРНК, кодирующие включение метионина во внутренние участки белка, прочитываются другой тЗРК^Мет

Элонгация

По завершении инициации рибосома располагается на мРНК таким образом, что в Р-центре находится инициирующий кодон AUG с присоединённой к нему Мет-тРНК_ш^Мет, а в А- центре – триплет,

Рис. 4-37. Образование инициирующего комплекса в ходе синтеза белка у эукариотов. Мет-тРНК^Метобъединяется с малой субъединицей рибосомы в форме тройного комплекса: Мет-тРНК^Мет, elF-2 и ГТФ. Образовавшийся более сложный четырёхкомпонентный комплекс присоединяется к 5'-концу мРНК с помощью нескольких дополнительных факторов, и малая субъединица начинает скользить по мРНК до тех пор, пока антикодон Мет-тРНК^Мет не свяжется с инициирующим кодоном AUG. При этом в комплексе происходит изменение состава инициирующих факторов, и ускоряется присоединение 60S субъединицы рибосомы, сопровождающееся гидролизом ГТФ. Мет-тРНКi^Мет занимает на рибосоме Р-центр

кодирующий включение первой аминокислоты синтезируемого белка. Далее начинается самый продолжительный этап белкового синтеза - элонгация, в ходе которого рибосома с помощью аа-тРНК последовательно "читает" мРНК в виде триплетов нуклеотидов, следующих за инициирующим кодоном в направлении от 5' к 3'-концу, наращивая полипептидную цепочку за счёт последовательного присоединения аминокислот.

Включение каждой аминокислоты в белок происходит в 3 стадии, в ходе которых:

• аа-тРНК каждой входящей в белок аминокислоты связывается с А-центром рибосомы;
• пептид от пептидил-тРНК, находящейся в Р-центре, присоединяется к α-NH₂-гpyппe аминоацильного остатка аа-тРНК А-центра с образованием новой пептидной связи;
• удлинённая на один аминокислотный остаток пептидил-тРНК перемещается из А-центра в Р-центр в результате транслокации рибосомы.

Связывание аминоацил-тРНК в А-центре. Кодон мРНК, располагающийся в А-центре рядом с инициирующим кодоном, определяет природу аа₁тРНК^aa₁, которая будет включена в А-центр. аа₁тРНК^aa₁ взаимодействует с рибосомой в виде тройного комплекса, состоящего из фактора элонгации EF-1, аа₁тРНК^aa₁ и ГТФ. Комплекс эффективно взаимодействует с рибосомой лишь в том случае, если антикодон аа-тРНК^aa₁ комплементарен и антипараллелен ко-дону мРНК в А-центре. Включение аа-тРНК^aa₁ в рибосому происходит за счёт энергии гидролиза ГТФ до ГДФ и неорганического фосфата (рис. 4-38).

Образование пептидной связи происходит сразу же после отщепления комплекса EF-1 и ГДФ от рибосомы. Эта стадия процесса получила название реакции транспептидации (рис. 4-39).

В ходе этой реакции остаток метионина Мет-тРНК_I^Мет связывается с a-аминогругшой первой аминокислоты, присоединённой к тРНК^aa₁ и расположенной в А-центре, образуется первая пептидная связь. Установлено, что пептидилтрансферазная активность большой субъединицы рибосомы принадлежит 28S рРНК. К настоящему времени обнаружена целая группа РНК, обладающая свойствами ферментов. Эти каталитически активные РНК получили название рибозимов (см. раздел 2). Полагают, что рибозимы можно считать "реликтами" раннего периода эволюции, когда белки ещё не приобрели такого значения, как в последующие периоды.

 

Рис. 4-38. Включение аа₁-тРНК^aa₁ в рибосому. aа₁-тРНК^aa₁ взаимодействует с рибосомой в виде тройного комплекса, состоящего из фактора элонгации EF-1I, аа₁-тРНK^aa₁ и ГТФ. Антикодон аа-тРНК^аа₁ комплементарен и антипараллелен кодону мРНК в А-центре. Связывание аа₁-тРНК^aa₁ происходит за счёт энергии гидролиза ГТФ до ГДФ и Р_i

Рис. 4-39. Реакция транспептидации. Метионин от Мет-тРНК_i^Мет, находящегося в Р-центре, присоединяется к α-МН₂ -группе аминоацильного остатка аа₁-тРНК^aa₁ А-центра с образованием новой пептидной связи.

Транслокация - третья стадия элонгации. К рибосоме присоединяется фактор элонгации EF-2 и за счёт энергии ГТФ продвигает рибосому по мРНК на один кодон к 3'-концу. В результате дипептидил-тРНК, которая не меняет своего положения относительно мРНК, из А-центра перемещается в Р-центр. Свободная от метионина тРНК_i^Мет покидает рибосому, а в область А-центра попадает следующий кодон (рис. 4-40).

По завершении третьей стадии элонгации рибосома в Р-центре имеет дипептидил-тРНК, а в А-центр попадает триплет, кодирующий включение в полипептидную цепь второй аминокислоты. Начинается следующий цикл стадии элонгации, в ходе которого на рибосоме снова проходят вышеописанные события. Повторение таких циклов по числу смысловых кодонов мРНК завершает весь этап элонгации.

 

Рис. 4-40. Стадия транслокации. К рибосоме присоединяется фактор элонгации EF-2, и за счёт энергии ГТФ продвигает рибосому по мРНК на один кодон к 3'-концу. Пептидил-тРНК, не меняя своего положения относительно мРНК, из А-центра перемещается в Р-центр.

Терминация

Терминация трансляции наступает в том случае, когда в А-центр рибосомы попадает один из стоп-кодонов: UAG, UAA или UGA. Для стоп-кодонов нет соответствующих тРНК. Вместо этого к рибосоме присоединяются 2 белковых высвобождающих фактора RF (от англ, releasingfactor) или фактора терминации. Один из них с помощью пептидилтрансферазного центра катализирует гидролитическое отщепление синтезированного пептида от тРНК. Другой за счёт энергии гидролиза ГТФ вызывает диссоциацию рибосомы на субъединицы (рис. 4-41).

Интересно отметить, что факторы трансляции, реализующие эффекты за счёт гидролиза ГТФ, являются членами суперсемейства G-белков, в которое входят G-белки, участвующие в трансдукции сигналов гормонов и других биологически активных веществ, и Ras-белки, функционирующие как факторы роста (см. разделы 11, 15). Все G-белки связывают и гидролизуют ГТФ. Когда они связаны с ГТФ, то активны и участвуют в соответствующих метаболических процессах, а когда в активном центре в результате гидролиза ГТФ превращается в ГДФ, эти белки приобретают неактивную конформацию.

Таким образом, матричная природа процесса трансляции проявляется в том, что последовательность поступления аминоацил-тРНК в рибосому для синтеза белка строго детерминирована мРНК, т.е. порядок расположения кодонов вдоль цепи мРНК однозначно задаёт структуру синтезируемого белка. Рибосома сканирует цепь мРНК в виде триплетов и последовательно отбирает из окружающей среды "нужные" аа-тРНК, освобождая в ходе элонгации деацилированные тРНК.

Малая и большая субъединицы рибосомы в процессе трансляции выполняют разные функции: малая субъединица присоединяет мРНК и декодирует информацию с помощью тРНК и механизма транслокации, а большая субъединица ответственна за образование пептидных связей.

Г. Полирибосомы

В процессе синтеза белка рибосома присоединяется к 5'-концу мРНК и перемещается в направлении 3'-конца. При этом 5'-конец мРНК освобождается, и к нему может присоединиться новая рибосома, на которой начинается рост ещё одной полипептидной цепи. Как правило,

Рис. 4-41. Терминация синтеза белка.

много рибосом одновременно участвует в синтезе белка на одной и той же мРНК, образуя комплекс, который называют полирибосомой, или полисомой (рис. 4-42).

Каждая рибосома занимает на мРНК участок длиной около 80 нуклеотидов, поэтому рибосомы располагаются на мРНК с интервалом примерно в 100 нуклеотидов. Чем длиннее полипептидная цепочка синтезируемого белка, тем больше рибосом может одновременно осуществлять синтез этого белка, значительно увеличивая таким образом эффективность использования матрицы.

Каждая рибосома способна катализировать образование около 100 пептидных связей в минуту. Полирибосомы могут существовать в виде частиц, плавающих в щггоплазме клеток, или могут быть связаны с ЭР. Свободные цитоготазматические полирибосомные частицы ответственны за синтез белков, выполняющих внутриклеточные функции. Полирибосомы, ассоциированные с ЭР, под электронным микроскопом имеют вид "шероховатой" поверхности. Белки, синтезируемые "шероховатым" ЭР, должны транспортироваться через мембрану для того, чтобы они достигли места окончательной локализации. Для

Рис. 4-42. Синтез белков на полирибосомном комплексе. Пять рибосом считывают информацию, содержащуюся в мРНК.

них характерно присутствие на N-конце лидер-ной, или сигнальной, последовательности длиной от 15 до 30 аминокислотных остатков, которая содержит много аминокислот с гидрофобными радикалами и обеспечивает прохождение белка через липидный бислой мембран. Некоторые из этих белков для дальнейшего транспорта упаковываются аппаратом Гольджи в секреторные гранулы.

Реализ ген инф в фенотипич признаки

: генетическая информация программирует синтез специфических белков, определяющих в свою очередь специфичность структуры и функции клеток, органов и целостного организма. В природе, как известно, существует два типа биополимерных макромолекул: так называемые неинформативные биополимеры (они представлены повторяющимися мономерными единицами и/или разветвленными структурами, например полисахариды, поли-АДФ-рибоза, пеп-тидогликаны, гликопротеины) и информативные биополимеры, несущие первичную генетическую информацию (нуклеиновые кислоты) и вторичную генетическую, точнее фенотипическую, информацию (белки). Эти общие представления могут быть выражены следующей последовательностью событий (поток информации):

ДНК –> РНК –> Белок –> Клетка –> Организм

Значительный вклад в современные представления о месте, факторах и механизме синтеза белка внесли исследования Т. Касперсона, М. Хоглан-да, П. Берга, П. Замечника, С. Очоа, М. Ниренберга, Н. Горовица, Ф. Гауровица, С. Вейсса и российских биохимиков А.А. Баева, А.Н. Белозерского, А.С. Спирина и др.