Связывание (обезвреживание) аммиака

Высокая интенсивность процессов дезаминирования аминокислот в тканях и очень низкий уровень аммиака в крови свидетельствуют о том, что в клетках активно происходит связывание аммиака с образованием нетоксичных соединений, которые выводятся из организма с мочой. Эти реакции можно считать реакциями обезвреживания аммиака. В разных тканях и органах обнаружено несколько типов таких реакций.

Основной реакцией связывания аммиака, протекающей во всех тканях организма, является синтез глутамина под действием глутамин-синтетазы:

Глутаминсинтетаза локализована в митохондриях клеток, для работы фермента необходим кофактор - ионы Mg²⁺. Глутаминсинтетаза - один из основных регуляторных ферментов обмена аминокислот и аллостерически ингибируется АМФ, глюкозо-6-фосфатом, а также Гли, Ала и Гис.

Глутамин легко транспортируется через клеточные мембраны путём облегчённой диффузии (для глутамата возможен только активный транспорт) и поступает из тканей в кровь. Основными тканями-поставщикам:и глутамина служат мышцы, мозг и печень. С током крови глутамин транспортируется в кишечник и почки.

 

22. Метод количественного определения мочевины в сыворотке крови.

Методы определения мочевины в плазме крови и моче можно разделить на две основные группы — «прямые» химические и ферментативные. К первой группе следует отнести титромерический метод и методы с использованием реакции Несслера или Бертело.

В титрометрическом методе аммиак определяли его титрованием в растворе серной кислоты в присутствии pH- индикатора.

Взаимодействие аммиака с реактивом Несслера в щелочной среде приводит к образованию комплекса желтого цвета, его структура до настоящего времени окончательно не выяснена.

Реакция Бертело между аммиаком и фенолом-гипохлоритом приводит к образованию синего индофенолового комплекса с максимумом поглощения при 630 нм [18]. Обе реакции могут быть проведены с сывороткой, кровью, мочой или с безбелковым фильтратом.

Поскольку концентрация мочевины в моче высокая, образцы мочи необходимо разводить перед исследованием. Концентрацию мочевины в моче рассчитывали по разнице результатов определения аммиака до и после обработки образца мочи ферментом уреазой.

Методы определения мочевины с помощью реакции Несслера редко используются в настоящее время и представляют исторический интерес.

Основная причина заключается в невозможности автоматизации этих методов и невысокой специфичности реакций. Хотя реакция Бертело в 10 раз более чувствительна по сравнению с реакцией Несслера (коэффициент молярного поглощения 20 000 л^–1 Х моль^–1 Х см^–1 по сравнению с 3000), она обладает относительно узким диапазоном, в котором соблюдается закон Бера.

Ферментативные методы. Все современные ферментативные методы определения мочевины основаны на использовании в качестве реактива фермента уреазы (КФ 3.5.1.5). Метод состоит из двух этапов. На первом при гидролизе мочевины образуется ион аммония, концентрацию которого определяют с использованием сочетанных ферментативных реакций, потенциометрических методов или технологий «сухой химии» [21].

Наиболее популярный метод определения мочевины в сыворотке крови или моче основан на использовании в качестве индикаторного фермента глутаматдегидрогеназы (ГлДГ). При наличии в реакционной среде всех необходимых для протекания реакции реактивов, внесение образца, содержащего мочевину, запускает реакцию. Уменьшение поглощения контролируют при 340 нм.

Для определения малых количеств мочевины в биологических жидкостях и микродиализатах был предложен кинетический люминометрический метод [24].

Метод основан на использовании уреазы (КФ 3.5,1.45), расщепляющей мочевину в АТФ-зависимой реакции. Данный фермент катализирует две последовательно протекающие реакции: биотин-зависимое карбоксилирование мочевины (реакция a) и гидролиз аллофаната, образующегося в первой реакции (реакция б). Скорость гидролиза АТФ контролируют с помощью люминометра в люциферин-люциферазной реакции.

Суммарная реакция: