Методы минерализации биоматериала.

Минерализация - п-с разрушения органич. в-в под д-ем физич. или химич. факторов с целью выделения металлов в форме, удобной д/анализа. Т.е. Минерализация- окисление (сжигание) органич. в-ва –объекта исслед-я и использ. для освобождения искомых органич. соед. из их комплексов с белками.

По назначению:

1. Общие м-ды (прим. при общем анализе биоматериала - исп. различн. окислители: H₂SO₄, HNO₃, H₂O_2, HClO₄-хлорная к-та,).

2. Частные м-ды-при направленном анализе. Это м-ды сплавления, сжигания материала, деструктивный м-д изолирования Hg.

Наиболее широко распростр. методы:

1. минерализ. путем простого сжигания, или «сухое озоление»,

2. минерализ. окислением различ. реагентами в присутствии кислот, или «мокрое озоление».

Деструкция — наруш. структуры биологич. материала под влиянием кислот, обладающих окислительными св-вами, без полного разруш-я органич. в-в, переходящих в деструктаты. Это первая стадия минерализации. При деструкции твердых частиц биолог. материала он разлагается и переходит в жидкую фазу (деструктат). Итак, после деструкции биолог. материала в деструктате в различн. кол-вах нах. ионы ртути, белки, пептиды, аминок-ты, липиды и др.

Для ускорения деструкции к биолог. материалу +этиловый спирт, кот. явл-ся катализатором этого процесса. Для удаления из деструктата азотной, азотистой кислот и оксидов азота, образ-ся в п-се деструкции, +мочевину.

В рез-те получается прозрачн. жидкость (деструктат), имеющ. желтоватую или бурую окраску.

Во второй стадии минерализации происходит разрушение (окисление) орг. в-в, нах-ся в жидкой фазе (деструктате), получ. после деструкции биолог. материала. Эта стадия разрушения более длительная, чем стадия деструкции. Для окончат. разрушения орг. в-в, нах-ся в жидкой фазе, к ней при нагревании по каплям прибавляют HNO₃. Полное разрушение орг. в-в в жидкой фазе зависит от кол-ва прибавл. HNO₃. От прибав. больших кол-в HNO₃ происх-т обильное выделение оксидов азота, выход. из колбы и загрязн-х атмосферу лаборатории.

От прибавления в колбу недостаточных к- HNO₃ находящиеся в ней орг. в-ва обугл-ся горячей H₂SO₄, о чем свидет-т потемнение жидкости в колбе. При этом из жидкости с выходящими газами могут улетуч-ся соединения мышьяка и ртути. Разрушение биолог. материала HNO₃ и H₂SO₄ считается законченным тогда, когда после прекращения добавления HNO₃ (при нагревании колбы) будут выделяться белые пары H₂SO₄ и не будет происходить почернение минерализата. Полученный минерализат исп-т для обнаружения и количеств. определения «металлич. ядов». Однако этому мешают азотная и азотистая кислоты, а также оксиды азота, нах-ся в минерализатах. В связи с этим минерализаты, получ. после разрушения биолог. материала, подвергают денитрации.

Минерализация серной и азотной кислотами.

Исп. д/опред. больш-ва катионов. В начале минерализации H₂SO₄ облад. низким окислит-м потенциалом, но как водоотнимающее в-во способств._. повышению T⁰ кипения реакц. смеси и этим повышает окислительное д-вие HNO₃ –более сильного окислителя, входящего в окислительную смесь. Благодаря водоотним. д-ю конц. H₂SO₄ нарушает структуру клеток и тканей биологич. материала. При повышении T⁰ (выше 110°С) и конц-ции (до 60-70 %) H₂SO₄ она проявляет окислительные св-ва и разлагается с выделением оксида серы (IV).

HNO₃, находящаяся в смеси с H₂SO₄, вначале минерализации явл. слабым окислителем. Со временем часть HNO₃при окислении биолог. материала превращ-ся в оксиды азота и азотистую кислоту- HNO₂, которые явл. автокатализаторами дальнейшего более интенсивн. п-са окисления орг. в-в азотной кислотой. С образованием оксидов азота и азотистой кислоты, а также с повышением температуры HNO₃проявляет себя как сильный окислитель.

Механизм минерализ. сводится в осн. к дегидратации органич. в-в, составляющих объект исслед-я и окислению их.

Техника Измельченный и перемешанный объект помещ в колбу Кьельдаля емкостью 300-350 мл., заливают смесью H₂O, H₂SO₄ конц, HNO₃ конц (1:1:1) из расчета 75 мл смеси на 100 гр материала. Если объект-жидкость(моча, молоко..)то ее смешив. с 25 мл H₂SO₄ конц и 25 мл HNO₃ конц и подвергают минерализ. Колбу закрепл. в штативе и осторожно нагревают (во избежание обугливания)на газов. горелке. В процессе минерализ. к содерж. колбы время от времени + по каплям HNO₃ конц(не допускать обугливания), регулируя п-с так, чтоб она полностью расходовалась на минерализ-ю и бурые пары оксидов азота не выходили из колбы.

Первая стадия минерализ. (Деструкция). Закл в разрушении форменных элементов и продолжается, при не очень жирном объекте,30-40 мин (объект бурого или желтого цвета с жирными каплями.)

Вторая стадия. - глубокое жидкофазное окисление. После разруш. формен. эл-тов колбу с содержимым подвергают более сильному нагреванию (избег. обугливания), постоянно + HNO₃ (1:1) до тех пор, пока полученная бесцветная жидкость при нагревании в теч. 30 мин без + HNO₃ не будет темнеть. Минерализ. закончена. Обычно это 3-4 часа (жирный объект-6-8 час) После разрушения и охлаждения объект обычно бесцветен или слегка желтоват и прозрачен. В прис. окрашенных ионов(Cu²⁺,Cr³⁺) м.б. окрашен, при наличии Pb²⁺,Ba²⁺, Ca²⁺ (после разбавления водой) м. сод. осадок.

«+» метода: быстрое достижение полноты разрушения орг. в-в. Полнота разрушения.-- Малые объемы получаемого минерализата.

«-»метода. Значит. потери Hg за счет летучести ее соединений. Поэтому этот м-д не прим. д/минерализ. объектов, сод. ртуть. Для изолирования Hg прим. деструктивный метод.

Сравнительная характеристика методов минерализации.

Минерализация серной и азотной кислотами (см. вопрос 27)

«+» метода: быстрое достижение полноты разрушения орг. в-в. Полнота разрушения. Малые объемы получаемого минерализата.

«-»метода. Значит. потери Hg за счет летучести ее соединений. Поэтому этот м-д не прим. д/минерализ. объектов, сод. ртуть. Для изолирования Hg прим. деструктивный метод.

Минерализ. H₂SO₄,HNO₃ и хлорной к-тами. Измельченный биоматериал помещ. в колбу Кьельдаля + H₂SO₄ конц и HNO₃ конц и HClO₄. Нагревают. При обугл. в колбу по каплям прибавляют конц. HNO₃. Если и при этом будет продолжаться обугливание, то ослаб-т нагревание колбы. Окисление биолог. материала продолжают прибавл-м по каплям р-ра HNO₃. Когда жидкость в колбе станет прозрачной, тогда прекращают нагревание и проверяют полноту окисления орг. в-в (прибавляют 25 %-й р-р аммиака; появление слабо-желтой). Этот метод непригоден для разруш. биолог. материала, подлежащего иссл. наличие ртути, кот. улетуч-ся в процессе минерализации.

«+» метода: полнота окисления орг. в-в-до 99%. HClO₄ разрушает устойч. к окислению компоненты биоматериала; окисление больш-ва поливалентных ионов до высшей степ. окисления; сокращ. времени минерализ. в 2-3 раза. Небольшой расход окисл-лей. – небольшой объем минерализата = повышает чувств-ть этого метода.

«-»метода особая предост-ть ввиду взрывоопасности HClO₄, потеря больших кол-в ртути. за счет летучести ее соед-й.

Методы сухой минерализации. Применяется редко, т.к. требует соблюдения некот. условий – небольшое кол-во объекта исследования и отсут. ртути. Метод исп-ся при спец. исслед-х на наличие мышьяка, серебра и при малых кол-вах объекта.

Техника: объект (1-2 г) растирают в фарф. чашке (4-6 г смеси) со смесью 2 частей Na₂CO₃ и 1 части нитрата натрия, смач-т H₂O и высуш-т на водяной бане. В тигель емкостью 30-50 мл помещают 5-6 г NaNO₃ и, нагревая, распл-т его. В расплав-м NaNO3, уменьшив нагрев, шпателем вносят малыми порциями подготовленный объект. След. порцию вносят лишь тогда, когда сгорела предыдущая. По сожжению всего объекта фарф. чашку неск-ко раз обраб-т сухим Na₂CO₃ и содержимое вносят в тигель. Тигель охл-т, содержимое обраб-т горячей водой и р-р анализ-т.

Минерализация простым сжиганием. Частный метод, имеющий огранич. примен. при исследовании на наличие солей Cu, Mn, фтористо- и кремнефтористоводородных кислот, иодидов.

Техника: объектвысуш-т, обугливаютв фарф. чашке при осторожном нагревании. Когда остаток обуглится или даже превратится в пепел, его смач-т конц. NH₄NO₃ или конц. HNO3, высушивают на бане, помещают в тигель и держат над пламенем горелки, добиваясь медленного тления объекта.

Золу обраб-т при нагр. HNO₃ или HCl и фильтруют.