Механізми функціонування транспортуючих систем синусоїдальної мембрани гепатоцитів

На синусоїдальній мембрані гепатоцитів знайдено молекулярні системи, які забезпечують поглинання гепатоцитами жовчних кислот, органічних і неорганічних катіонів і аніонів, неетерифікованих жирних кислот (Coleman, 1987; Масюк, 1990; Moseley et al., 1990; Nathanson, Boyer, 1991; Coleman, Rahman, 1992; Dieminger et al., 1995; Meier et al., 1995).

Поглинання гепатоцитами жовчних кислот із крові здійснюється за участю рецепторів (транспортерів) жовчних кислот - інтегральних білків синусоїдальної мембрани гепатоцита (Coleman, 1987; Frimmer, Ziegler, 1988; Meier et al., 1987, 1995; Масюк, 1990; Nathanson, Boyer, 1991; Meier, 1995). Ці транспортери жовчних кислот функціонують у всіх гепатоцитах печінкового ацинусу. Однак за фізіологічних умов транспорт жовчних кислот здійснюється переважно перипортальними гепа­тоцитами, що створює лобулярний градієнт жовчних кислот між перипортальною і перивенозною ділянками гепатоцита (Gumucio, Guibert, 1993).

Поглинання жовчних кислот із портальної крові є досить ефективним процесом, в результаті якого до гепатоцита надходить 90 % кон'югатів холевої кислоти і 75-80 % кон'югатів хенодезокси-, дезокси-, урсодезоксихолевої кислот (Meier, 1995).

Оскільки більша частина (біля 85%) жовчних кислот знаходиться у крові у вигляді комплексів білок плазми (головним чином, альбумін) - сіль жовчної кислоти (Ганиткевич, 1980; Strange, 1984), можна припустити, що у механізмах поглинання жовчних кислот гепатоцитами альбумін виконує властиву йому транспортну функцію, завдяки чому полегшується взаємодія жовчних кислот із специфічними рецепторами синусоїдальної мембрани (Frimmer, Ziegler, 1988; Sorrentino et al., 1994).

Надходження жовчних кислот до гепатоцита є вторинним Na⁺-залежним активним процесом. Система Na⁺-залежного транспорту жовчних кислот здатна перенести через плазматичну мембрану 80 % таурохолевої і близько 50 % холевої кислот (Scharschmidt, Stephens,1981; Van Dyke et al., 1982; Yamazaki et al., 1993; Boelsterli et al., 1995).

Із синусоїдальної мембрани гепатоцитів щурів виділений, охарактерізований і клонований транспортер жовчних кислот - поліпептид, який налічує 362 амінокислотних залишки (Boyer et al., 1994; Stieger et al., 1994). Він вбудований у базолатеральну мембрану і не знайдений в плазматичних мембранах епітеліальних клітинах жовчних протоків (Hagenbuch et al., 1991). Аналогічний поліпептид виділений з печінки люди­ни (Hagenbuch, Meier, 1994) і кишечника хом'яка (Wong et al., 1994). Na⁺-котранспортуючий поліпептид є основним, але не єдиним транспортером жовчних кислот (Hagenbuch, Meier, 1994; Meier et al., 1995). З ним зв'язуються переважно кон'юговані тригідроксихоланові кислоти з довгим боковим ланцюгом і негативним зарядом (Hagenbuch et al., 1991; Boyer et al., 1994; Schroeder et al., 1994). Хоча некон'юговані жовчні кислоти, такі як холева і урсодезоксихолева, теж є субстратом для Na⁺-котранспортуючого поліпептиду, їх основним шляхом надходження в гепатоцит є Na⁺-незалежний шлях, в тому числі і дифузія жовчних кислот через мембрану (Lake et al., 1987; Hardison et al., 1988; Caflisch et al., 1990; Veith et al., 1992; Boelsterli et al., 1995). Потужність цього транспортера достатня для зв'язування і трансмембранного перенесення тієї кількості жовчних кислот, яка є у портальній крові тварин і людини. Na⁺-залежний транспортер жовчних кислот не знайдений у нирках ссавців і печінці хребетних, які не відносяться до класу ссавців. Встановлено (Rabergh et al., 1994; Hagenbuch et al., 1994), що надходження холевої і таурохолевої кислот в ізольовані гепатоцити райдужної форелі є Na⁺--незалежним. Ізоосмотична заміна позаклітинного Na⁺ на Li⁺, холін або K⁺ не викликала змін у поглинанні жовчних кислот. Na⁺-залежне надходження жовчних кислот є характерною ознакою диференційованих гепатоцитів ссавців. Na⁺-залежний транспорт жовчних кислот через синусоїдальну мембрану знижу­ється після часткової гепатектомії, а потім відновлюється (Green et al., 1994), значно знижується з часом у первинній культурі гепатоцитів (Follmann et al., 1990; Liang et al., 1993), відсутній в клітинній лінії гепатоми (Marchegiano et al., 1992; Von Dippe, Levy, 1983; Blumrich et al., 1994) і нижчих хребетних (Fricker et al., 1987; Smith et al., 1987; Rabergh et al., 1994). В онтогенезі названа вище функція гепатоцитів з'являється вперше в ембріональній печінці щурів на 20 добу (Ananthanarayanan et al., 1991), тобто ген, який кодує Na⁺-залежний транспорт жовчних кислот, починає експресуватися на пізніх етапах пренатального розвитку організму (Boyer et al., 1993). Після порушення ентерогепатичної циркуляції жовчі функція Na⁺-залежного транспортужовчних кислот знижується (Accatino et al., 1993; Higgins et al., 1994). Hавпаки, підвищення функції спостерігається у стані голоду (Dumaswala et al., 1994; Ganguli et al., 1994; Liu et al., 1995). цАМФ швидко стимулює максимальний рівень транспорту жовчних кислот (Grune et al., 1993). Інтерлейкін-6 пригнічує Na⁺-залежний транспорт таурохолевої кислоти, що, можливо, пов'язано із пригніченням активності Na⁺K⁺-АТФази (Green et al., 1994а).

Один з протеїнів, який бере участь у Na⁺-залежному транспорті жовчних кислот через синусоїдальну мембрану і в електрогенному транспорті таурохолевої кислоти в гладенькому ендоплазматичному ретикулумі, був ідентифікований як мЕГ-мікросомальна епоксидна гідролаза. Асоційована з плазматичною мембраною мЕГ подібна до інших протеїнів, які зв'язують жовчні кислоти, і може функціонувати як ранній акцептор жовчних кислот в тісному контакті з ліпідним бішаром плазматичної мембрани. Остаточно роль мЕГ у Na⁺-залежному транспорті жовчних кислот не з'ясована (Alves et al., 1993; Von Dippe et al., 1993). Субстратну специфічність Na⁺-котранспортуючого поліпептида не вдалось визначити, тому що через цю транспортну систему надходять у гепатоцит кон'югати естрогена (17-естрадіол-3-сульфат), циклічні олігопептиди (фалоїдин, циклосоматостатин) і ліки (буметанід, фуросемід, циклоспорин А). Але деякі з цих речовин надходять до гепатоцита і через Na⁺-незалежну транспортну систему, тому досить важко визначити специфічність (селективність) транспортера жовчних кислот (Hardison et al., 1984; Wieland et al., 1984; Bellentani et al., 1987; Frimmer, Zieger, 1988; Zimmerli et al., 1989; Moseley et al., 1990; Petzinger et al., 1993; Petzinger, 1994; Terasaki et al., 1995).

Описаний раніше Nа⁺-незалежний транспортер жовчних кислот, молекулярна маса якого 54 кДа (Frimmer, Ziegler, 1988), забезпечує поглинання жовчних кислот клітинами печінки нижчих хребетних, але не ссавців. У ссавців цей транспортер забезпечує поглинання гепатоцитами інших органічних аніонів (Nathanson, Boyer, 1991).

Поглинання органічних аніонів є третинним Сl^--залежним активним процесом. Дослідженнями експресії м-РНК із клітин печінки щурів в ооцитах ксенопусу доведено (Jacquemin et al., 1991), що Na⁺-залежний транспортер жовчних кислот і Na⁺-незалежний транспортер інших органічних аніонів кодуються різними генами. Деяка частина жовчних кислот поглинається гепатоцитами за участю принципово інших механізмів, наприклад, за участю мікрофіламентної і мікротрубочкової систем клітини (Coleman, Rahman, 1992). Це підтверджують дані про пригнічення надходження в ізольовані гепатоцити таурохолевої кислоти при дії на клітини цитохалазину В і колхіцину - інгібіторів названих систем (Масюк, 1990). Поглинання гепатоцитами частини екзогенних і ендогенних органічних катіонів є енергозалежним, але Na⁺-незалежним процесом. Воно здійснюється за участю обмінника органічний катіон-Н⁺, молекулярна природа якого не встановлена (Moseley et al., 1990). Великі ендогенні і екзогенні органічні катіони поглинаються гепатоцитами шляхом ендоцитозу.

Білки, як і жовчні кислоти, відносяться до осмотично-активних компонентів жовчі, які обумовлюють інтенсивність її секреції. Основний внесок у створення осмотичного градієнта вносять, за думкою (Kakis, Yousef, 1978), альбумін та інші, близькі за молекулярною масою до альбуміну, білки. На користь припущення про участь білків у механізмах секреції жовчі свідчать дані (Масюк и соавт. 1992) про односпрямовані зміни інтенсивності секреції жовчі і білків у жовчні каналікули за умов пригнічення біосинтезу білка у гепатоцитах циклогексимідом, актиноміцином Д і пуроміцином.У жовчі знайдено десятки індивідуальних білків з молекулярною масою від 6 до 220 кДа (LaRusso, 1984; Масюк, 1989). Більша частина із них є білками крові, менша представлена білками, які надходять у жовч безпосередньо із гепатоцитів і епітеліальних клітин жовчних протоків. Експериментальні дані дозволяють стверджувати (LaRusso, 1984; Масюк 1989; Marks, LaRusso, 1993), що більшість білків плазми крові взаємодіє із специфічними рецепторами, які розташовані на синусоїдальній мембрані гепатоцита, де створюють комплекс білок плазми-рецептор, що надходить в гепатоцит шляхом ендоцитозу.

Надходження до гепатоцита неорганічних катіонів і аніонів здійснюється за участю специфічних іонних каналів та транспортерів, до яких відносяться Nа⁺,К⁺-АТФаза, Nа⁺-Н⁺ обмінник, Nа⁺-НСО₃^- 0котранспортер, Na⁺-незалежний транспортер SO₄^-. Молекулярна природа Nа⁺-H⁺ обмінника та Nа⁺-НСО₃ –котранспортера синусоїдальної мембрани гепатоцита вивченанедостатньо (Масюк, 1990; Nathanson, Boyer, 1991). Роль Nа⁺-Н⁺ обмінника, основною функцією якого є підтримання внутрішньоклітинного pH, у механізмах секреції жовчі полягає, мабуть, в його здатності за певних умов підсилювати надходження іонів натрію до гепатоцита. Nа⁺-НСО₃^-котранспортер, який відіграє також важливу роль у підриманні внутрішньоклітинного pH, у механізмах секреції жовчі гепатоцитами безпосередньої участі, очевидно, не бере. Роль Na⁺-незалежного транспортера SO₄^- у механізмах секреції жовчі не встановлена (Nathanson, Boyer, 1991). В гепатоцитах ссавців Na⁺-незалежний транспорт характерний для некон'югованих жовчних кислот та деяких органічних аніонів (Van Dyke et al., 1982; Frimmer, Ziegler, 1988; Petzinger, 1994; Boelsterli et al., 1995). Із базолатеральної мембрани печінки щурів виділений і клонований глікопротеїн - мультиспецифічний транспортер органічних аніонів-1, якій налічує 670 амінокислотних залишків, має молекулярну масу 80 кДа. Він знайдений також в тканині нирок і мозку (Jacquemin et al., 1991; 1994). Аналогічний транспортер виділений і клонований з печінки людини (Kullack-Ublick et al., 1995). Механізми надходження органічних аніонів, інших ніж жовчні кислоти, до гепатоцита частково досліджені. Є екпериментальні докази того (Sorrentino et al., 1994), що за умов фізіологічної концентрації альбуміну надходження до гепатоцита таурохолату і бромсульфофталеїну безпосередньо залежить від концентрації не зв'язаних лігандів. Ідентифіковані також специфічні транспортери, які опосередковують Cl^--залежний транспорт бромсульфофталеїну та білірубіну і Na⁺-залежний транспорт жовчних кислот. Два типи названих транспортерів не мають спільної функціональної та структурної основи, хоча транспортер бромсульфофталеїну/білірубіну може бути використаний за певних умов для Na⁺-залежного транспорту різних жовчних кислот. Органічні аніони, такі як бромсульфофталеїн і білірубін, знаходяться у крові у зв'язаному з альбуміном стані. При надходженні у печінку 50% аніонів залишається у гепатоцитах. Дослідження в культурі гепатоцитів показали, що транспорт органічних аніонів залежить від температури, потребує наявності неорганичних аніонів (Cl^-) і пригнічується за умов зниження рівня АТФ у клітині (Sorrentino et al., 1994).

Жовчні кислоти, такі як урсодезоксихолева, тауроурсодезоксихолева, таурохолева, дезоксихолева пригнічують надходження бромсульфофталеїну до гепатоцита. Яким чином здійснюється їх вплив на транспортер бромсульфофталеїну, невідомо. Можна припустити, що це відбувається в результаті зміни біохімічного стану мембрани (її текучості), чи при безпосередній взаємодії жовчної кислоти з транспортером бромсульфофталеїну. Дані свідчать, що здатність клітин печінки поглинати з крові органичні аніони регулюється жовчними кислотами. У дослідах на клітинах гепатоми було встановлено, що вони втрачають високочутливий Cl^--залежний транспортер органічних іонів, який є характерною ознакою диференційованих гепатоцитів (Ishii, Wolkoff, 1994).

Однією з важливих функцій транспортера органічних аніонів-1 є перенесення через базолатеральну мембрану кон'югатів стероїдів, нейтральних стероїдів, амфіпатичних органічних катіонів і похідних антиаритмічних речовин (Kullack-Ublick et al., 1995, 1996; Meier, 1995). Крім того, транспортер органічних аніонів-1 може виконувати функції захисту синусоїдальної мембрани, попереджаючи аккумуляцію токсичних жовчних кислот в клітині під час холестазу. Існує припущення (Shi et al., 1995), що транспортер органічних аніонів опосередковує перенесення органічних аніонів через синусоїдальну мембрану в обох напрямках.

Таким чином, транспортер органічних аніонів являє собою поліспецифічну транспортну систему, через яку надходять у клітину різноманітні органічни субстрати, але механізми його функціонування не відомі.

Внутрішньоклітинні метаболічні процеси, які лежать в основі секреції жовчі гепатоцитами

Гепатоцити, як відомо, секретують біля 90% жовчних кислот, які повернулись у клітину в процесі ентерогепатичної циркуляції, і біля 10% жовчних кислот, синтезованих de novo (Ганиткевич, 1980; Strange, 1984; Coleman, 1987; Масюк, 1990).

Жовчні кислоти є специфічним продуктом діяльності гепатоцита, який утворюється в результаті багатьох метаболічних реакцій перетворення холестерину (Vlahcevic, 1995). Вважають, що в печінці ссавців синтезуються холева і хенодезокси­холева кислоти (первинні), а знайдені у жовчі дезоксихолева і літохолева кислоти (вторинні) є результатом діяльності кишкової мікрофлори (Vlahcevic, 1995). Показано також (Kok et al., 1981; Takita et al., 1988), що в печінці ссавців, окрім холевої і хенодезоксихолевої, може бути синтезована і літохолева кислота.

В печінці ссавців першим і найбільш важливим етапом синтезу жовчних кислот, який обмежує швидкість процесу в цілому, є реакція гідроксилювання циклічної частини молекули холестерину у 7a-положенні. Ця реакція каталізується мікросомальною холестерин 7a-гідроксилазою, яка являє собою багатокомпонентну ферментну систему (Russell, Setchell, 1992). Регуляція активності холестерин-7a-гідроксилази здійснюється шляхом її фосфорилювання-дефосфорилювання, а у деяких випадках шляхом індукції-репресії синтезу фермента (Sanghvi et al., 1981; Kwekkeboom et al., 1988; Stravitz et al., 1995, 1996). Пік рівня холестерин 7a-гідроксилази визначається опівночі, незабаром після піка акумуляції DBP (білка, який активує процес транскрипції і накопичується у великій кількості тільки в ядрах клітин печінки дорослих щурів). Циклічні зміни рівня активності DBP не залежать від впливу зовнішніх факторів і є первинними сигналами ініціації транскрипції (Lavery, Schibler, 1993). Регуляція холестерин -7a-гідроксилази здійснюється на транскрипційному рівні. Було знайдено, що DBP взаємодіє з промоторною ділянкою гена холестерин 7a-гідроксилази і таким чином регулює транскрипцію. Субстратом для холестерин-7a-гідроксилази є холестерин ліпопротеїдів і de novo синтезований холестерин, який знаходиться у гладенькому ендоплазматичному ретикулумі. Холестерин, синтезований de novo, використовується переважно для біосинтезу жовчних кислот (Chiang et al., 1995; Vlahcevic, 1995; Vlahcevic et al., 1996).

Синтезовані de novo жовчні кислоти кон'югують з амінокислотами таурином і гліцином і в такому, чи у вільному стані транспортуються у периканалікулярну ділянку гепатоцита (Strange, 1984; Coleman, 1987; Масюк, 1990; Falany et al., 1994). Внутрішньоклітинне переміщення синтезованих і погли­нених гепатоцитами жовчних кислот із крові здійснюється, очевидно, за участю одних і тих же механізмів, а саме:

- за участю білків-транспортерів;

- спрямованого везикулярного транспорту жовчних кислот. Відомі три класи внутрішньоклітинних білків, які зв'язують жовчні кислоти, і, мабуть, беруть участь у їх переміщенні в периканалікулярну ділянку гепатоцита:

- глутатіон-S-трансферази, які зв'язують ліганди, які не є для них субстратом. До останніх відносяться вільні первинні (холева і хенодезоксихолева) і, головним чином, вторинні (літохолева) жовчні кислоти (Strange, 1984; Stolz et al., 1989, 1995; Масюк, 1990; Nathason, Boyer, 1991),

Y'-білок (3a-гідроксистероїддегідрогеназа) - зв'язує кон'юговані жовчні кислоти і некон'юговану хенодезоксихолеву кислоту (Stolz et al., 1989, 1995; Nathanson, Boyer, 1991, Gartung et al., 1996),

- білок, який зв'язує жирні кислоти, зв'язує також і жовчні кислоти (Stolz et al., 1989, 1995; Nathanson, Boyer, 1991).

Роль глутатіон-S-трансфераз і білка, який зв'язує жирні кислоти, у механізмах внутрішньоклітинного транспорту жовчних кислот незначна. Можливо, ці білки, зв'язуючи жовчні кислоти, перешкоджають їх поверненню з гепатоцита через синусоідальну мембрану у кров і утримують жовчні кислоти у цитозолі, порушучи їх взаімодію з внутрішньоклітинними органелами (Stolz et al., 1989, 1995; Масюк, 1990; Nathanson, Boyer, 1991).

Основним білком, який транспортує жовчні кислоти, є Y'-білок, однак механізми цього транспорту не з'ясовані. Можливо, транспорт жовчних кислот здійснюється шляхом внутрішньоклітинної дифузії комплексу Y`-білок - жовчна кислота, або послідовним зв'язуванням однієї жовчної кислоти багатьма Y`-білками (конвеєрний тип переміщення).

Спрямований везикулярний внутрішньоклітинний транспорт жовчних кислот здійснюється за участю мікротрубочкової системи, гладенького ендоплазматичного ретикулуму і апарату Гольджі, однак, можливо, він не відіграє основну роль у механізмах транспорту жовчних кислот у периканалікулярну ділянку гепатоцита, оскільки переміщення жовчних кислот у клітині здійснюється з достатньо великою швидкістю. Внутрішньоклітинний везикулярний транспорт жовчних кислот, мабуть, відіграє важливу роль у тому випадку, коли концентрація жовчних кислот у клітині підвищується до такого рівня, що вони починають утворювати міцели (Grawford et al., 1988; Nathanson, Boyer, 1991; Coleman, Rahman, 1992; Kast et al., 1994; Boyer, Soroka, 1995).

Везикулярний транспорт залежить в значній мірі від функціонування мікротубулярного апарату, що було показано численними дослідженнями (Goldsmith et al., 1983; Suchy et al., 1983; Alves et al., 1993; Pikula et al., 1994, 1994а), в яких секреція білків і ліпідів та їх транспорт і секреція пригничувались інгібіторами мікротубулярної системи.

У всіх еукаріотичних клітинах мікротубулярний транспорт, за даними (Marks et al., 1995), знаходиться під контролем кинезину і динеїну, які гідролізують АТФ для підтримки переміщення везикул уздовж мікротубулярної системи. Активність кинезину печінки, який виявляється у гепатоцитах у комплексі Гольджі, пригнічувалась істотно in vitro кон'югованими хенодезоксихолевою і холевою кислотами, але не урсодезоксихолевою кислотою. Існує припущення, що холестатичні жовчні кислоти впливають на секрецію білків плазми і їх трансцитоз шляхом прямого пригнічення кинезину (Marks et al., 1995).

Чутливість секреції жовчних кислот до інгібіторів мікротубулярної системи (колхіцину) за нормальних умов мінімальна. Однак, якщо рівень секреції міцелоутворюючих жовчних кислот значно збільшується, наприклад після їжі, то він може істотно пригнічуватись інгібіторами мікротубулярної системи. Таким чином, мікротубулярна система здійснює спрямований везикулярний транспорт жовчних кислот за різних фізіологічних умов (Coleman 1987; Aoyama et al., 1991; Wilton et al., 1994).

Спрямований везикулярний внутрішньоклітинний транспорт жовчних кислот здійснюється також за участю гладенького ендоплазматичного ретикулуму. За даними (Alves et al., 1993), транспорт таурохолату у везикулах гладенького ендоплазматичного ретікулуму є Na⁺-незалежним, електрогенним, пригнічується таурохенодезоксихолевою кислотою. Везикулярний транспорт жовчних кислот здійснюється біфункціональним протеїном - мікросомальною епоксидною гідролазою (мЕГ), яка може опосередковувати також транспорт жовчних кислот до гепатоцита через синусоїдальну мембрану. мЕГ була виділена з мембран гладенького ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів іммунопреципітацією з використанням моноклональних антитіл (Alves et al., 1993; Von Dippe et al., 1993; Meier, 1995).

Внутрішньоклітинне переміщення білків із присинусоідальної ділянки гепатоцита у периканалікулярну ділянку здійснюється, головним чином, шляхом спрямованого везикулярного транспорту. Значна кількість білків, які надходять у гепатоцит із крові у вигляді комплексу рецептор-білок плазми, створюють рецептосому (ендосому) і в такому вигляді транспортуються до апарату Гольджі і далі до каналікулярної мембрани (LaRusso, 1984; Масюк, 1989; Marks, LaRusso, 1993).

У деяких випадках ендосоми, які містять білки плазми, зливаються з лізосомами, утворюючи вторинні лізосоми. У вторинних лізосомах білкі крові підлягають дії лізосомальних гідролаз і або звільняються у цитозоль, або в дещо трансформованому вигляді залишаються у вторинних лізосомах, переміщуючись разом з ними до каналікулярної мембрани гепатоцита. У периканалікулярну ділянку не завжди транспортується комплекс рецептор-білок плазми. Якщо цей комплекс руйнується, білок надходить у лізосому, а рецептор реутилізується, тобто знову вбудовується у синусоїдальну мембрану, виконуючи свої функції багаторазово (LaRusso, 1984; Масюк, 1989; Marks, LaRusso, 1993).

Синтезовані de novo білки, які надходять у жовчні кана­лікули безпосередньо із гепатоцитів, також переміщуються у периканалікулярну ділянку шляхом спрямованого везикулярного транспорту. Однак, на відміну від інших клітин, у яких синтезовані білки переміщуються адресно, тобто безпосередньо до місця свого функціонування, у гепатоцитах синтезовані de novo білки спочатку транспортуються до синусоїдальної мембрани, де відбувається їх пересортування, і тільки після цього вони переміщуються у периканалікулярну ділянку (Noe et al., 1996).