Лекція . Апоптоз в органах клітин шлунково-кишкового тракту.

ВСТУП

Загибель клітин відіграє таку ж важливу роль у функціонуванні організму як і проліферації.

У вищих організмів гомеостатичний контроль кількості клітин є результатом динамічної рівноваги між клітинною проліферацією і клітинною загибеллю.

Чому це так? Відповідь на це питання буде скоріш філософська, оскільки вимагатиме пригадати такі основні категорії як час, швидкість, циклічність функціонуючих систем організму, що забезпечує економічність. Не забуваймо і про потребу у відмиранні тимчасових систем при рості і формуванні організму як з прямим, так і непрямим розвитком.

Еволюційно рано у багатоклітинних організмів (перш за все тваринних) виник генетично запрограмований, чітко скоординований з екзо- і ендогенними сигналами фізіологічний процес руйнування “непотрібних” клітин: тих, що “відпрацювали”, або є “небезпечними” оскільки містять генетичні помилки, чи уражені пошкоджуючими факторами різної природи.

Високоспеціалізовані клітини щоб оптимально ефективно виконувати свою функцію мають тою чи іншою мірою втратити універсальність. Крайній приклад – еритроцити, імунокомпетентні лімфоцити.

Термін “апоптоз” був запропонований Wylli et al. (Ендрю Уілі і співавторами) у 1972році. В перекладі з давньогрецької означає: аpo – відділення + ptosis – падіння і в контексті древнього свого використання це словосполучення може тлумачитись як “опадання листя”.

Концепція про те, що розвиток патологічних процесів в організмі зумовлений масовою катастрофічною загибеллю окремих його клітин склалася ще в ХІХ столітті завдяки роботам видатного німецького вченого Рудольфа Вірхова. Зміна акцентів щодо патогенетичної ролі втрати рівноваги між утворенням і загибеллю клітин відбулася, зокрема, із відкриттям американськими вченими Стенлі Корсмейєром і Робертом Горвіцем “генів смерті” у кінці ХХ століття.

Таким чином, апоптоз є необхідним для підтримання гомеостазу (постійності клітинного складу) і комплементарний діленню клітин (проліферативним процесам).

 

2.МОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ ПРИ АПОПТОЗІ.

Апопотоз характеризується паралельними морфологічними і біохімічними змінами в клітинах. Морфологічні зміни:

1. Індукторний проапоптичний сигнал (активація апоптозу)

буває різної природи. Залежно від природи стимулу і від типу клітини необхідна різна інтенсивність і тривалість дії проапоптичного фактора для розвитку апоптозу.

2. Конденсація хроматину в ядрі біля ядерної оболонки.

Далі йде розпад ядра на дискретні фрагменти оточені мембраною.

 

3. Конденсація цитоплазми: розрив цитоскелету апоптичної клітини, руйнування міжклітинних контактів (таким чином апоптизуюча клітина ізолюється від сусідніх клітин). На поверхніапоптичних клітин утворюються структури (пухирці) важливі для розпізнавання сусідніми клітинами і макрофагами.

4. Фрагментація апоптизуючої клітини до невеликих оточених мембранами “апоптичних тілець” які містять частини фрагментованого ядра, органели, частини цитоплазми.

5. Фагоцитоз і деградація сусідніми клітинами і тканинними макрофагами апоптичних тілець за участю лізосомальних ферментів фагоцитуючих клітин.

 

3. БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ І ГЕНЕТИЧНА ПРОГРАМА АПОПТОЗУ.

Апоптоз є генетично запрограмованим і енергозалежним процесом. При експериментальному пригніченні експресії генів, біосинтезу білку та утворення АТФ (роботи мітохондрій) індуктори апоптозу не викликають його у клітинах. Тобто саме внутрішньоклітинним реакціям, а, значить, і цілій низці рецепторів і ферментів належить основна “апоптозорганізуюча” роль.

Можна виділити такі етапи (стадії) апоптозу: -первинна активація апоптозу, тобто, напр., дія проапоптичного фактору на рецептор (антиген); -далі передача сигналу в клітину й в клітині; -активація певних генів; -синтез білків “проапоптичних”, в ядрі –активація ендонуклеаз і фрагментація ДНК.

Молекулярні механізми апоптозу [Кайдашев, 1998] –початковий механізм активації апоптозу; -клітинні механізми, що забезпечують апоптоз; -генетичний контроль блокади й активації апоптозу; -молекули які інгібують або модулюють апоптоз.

Плазматична мембрана.

а) Плазматичні мембрани клітин містять трансмембранні рецептори – білки, які беруть участь у ініціації апоптозу – це, наприклад, Fas/Apo-1 (CD95) трансмембранний рецептор, який після взаємодії з відповідними лігандами індукує програмовану загибель клітини. Fas – рецептор належить до суперродини рецепторів факторів росту нервів і фактора некрозу пухлин. Він має екстрацелюлярний домен, трансмембранний домен і інтрацелюлярний домен, який є “доменом загибелі ” (з ним взаємодіє ліганд). Має цей рецептор і “ домен порятунку ”, який гальмує апоптоз індукуючі процеси. Ліганд рецептора Fas виділений з цитотоксичних Т-лімфоцитів. Взаємодія сигнальних молекул з рецепторами ініціює активацію ліполітичних ферментів (фосфоліпази С, А₂, D і сфінгомієлінази) з наступним накопиченням продуктів гідролізу фосфоліпідів (арахідонової кислоти і її похідних – лейкотрієнів, діацилгліцеролу, цераміду інозитолтрифосфату та інш.).

Інший шлях участі СД95 – активація сфінгомієлінового шляху: стимулюється сфінгомієліназа – гідроліз мембранного сфінгомієліну на фосфохолін та церамід – церамід, як вторинний посередник (месенджер), викликає наступні етапи апоптозу. А саме, церамід активує церамід залежну протеїнкіназу, яка через низку цитоплазматичних білків приводить до зниження (блокування) проліферації і зниження експресії гену c-myc(його продукти – ядерні білки, які активують ядерні процеси).

Зазначимо, що експресія Fas-рецептора відбувається у інфікованих гепатоцитах (деякі вірусні інфекції печінкові).

б) При апоптозі відбувається порушення проникності іонотрофних рецепторів плазматичної мембрани (і внутрішньоклітинних мембран), які регулюють вміст калію, натрію, хлору, кальцію в результаті дії амінокислот аспартату і глутамату (нейротрансмітери). Особливо важливе підвищення концентрації кальцію в клітині.

в) Порфирином Т-лімфоцитів формуються пори через які у клітину проникають і іони кальцію і гранули з гранзимом В – активатором каспаз.

г) ПОЛ. Дуже часто апоптоз супроводжується посиленням перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і розвитком окислювального стресу.

д) Фізико-хімічні зміни клітинних мембран – фосфоліпіди плазматичної мембрани є джерелом вторинних посередників, що приймають участь у регуляції ферментів апоптозу (протеїнкіназ, фосфатаз, протеаз). Ці посередники – арахідонова кислота і її похідні лейкотрієни, діацилгліцерол, інозитолфосфат та інш. Перебудовуються вуглеводні компоненти мембрани (з втратою сіалових кислот), що надає можливості взаємодії апоптизуючої клітини з макрофагами. Відбувається інверсія мембранних фосфоліпідів: зазвичай зовнішня поверхня мембранного бішару містить в основі нейтральні фосфоліпіди сфінгомієлін і фосфотидилхолін, тоді як від’ємно заряджені фосфоліпіди на внутрішній стороні. У апоптозуючих клітин назовні розташовується фосфатидилсерин, який розпізнається специфічним макрофагальним рецептором.

е) Кріплення апоптичної клітини до макрофагу тромбоспондіном, білком який синтезується і виштовхується у мікрооточення макрофагами.

 

2. Цитоплазма. Основними внутрішньоклітинними апоптичними подіями є розщеплення внутрішньоклітинних білків, перш за все білків цитоскелету, а також рецепторних білків клітини. Ці реакції відбуваються завдяки активації цистеїнових протеаз – каспаз. Екзогенно, з цитотоксичних лімфоцитів як компоненти утворюваних ними цитоплазматичних гранул, надходять до клітин, що апоптизують серинові протеази, наприклад грамзин В / фрагментин.

 

3. Внутрішньоклітинні органели. Значна частина сучасних наукових відкриттів дозволяє вважати, що в більшості випадків вирішальною для перебігу апоптозу і, взагалі, для його ініціації є зміни функціонування мітохондрій. В 1996 році Wang et al. Дослідили як в клітинах людини функціонує “екзекуційна” каспаза-3. Для активації цього ферменту з неактивної форми (прокаспаза-3) необхідно два білки: Apaf-1(фактор активації апоптичних протеаз) і цитохром с, який є мітохондріальним білком і потрапляє до цитоплазми завдяки зміні проникності мітохондріальної мембрани для нього Це не єдиний апоптогенний білок мітохондрій. До таких належить і AIF – апоптоз-індукуючий фактор – флавопротеїн, здатний до індукції конденсації і фрагментації ДНК в ізольованому ядрі незалежно від активності “каспазного шляху апоптозу”. Цей білок змінює і трансмембранний мітохондріальний потенціал та розташування фосфатидилсерину в плазматичній мембрані. Гомологи цього білка знайдені у трьох царствах багатоклітинних: тварин, рослин і грибів, що свідчить – AIF може бути одним з найдавніших та “найспадковіших” факторів загибелі клітин. Під час апоптозу з мітохондрій звільняється ще один білок – Diablo/Smac, який нейтралізує інгібіторів каспаз (IAPs), чим і “звільняє” каспази для їх апоптогенної роботи. Загалом, шляхи надходження мітохондріальних білків індукторів апоптозу – питання, що нині інтенсивно досліджується науковцями.

Зазначимо, що зміна функцій і структури мітохондрій – один з ключових моментів перебігу апоптозу. Зокрема, Са-залежна зміна проникності внутрішньої мітохондріальної мембрани пов’язана з мітохондріальної деполяризацією, роз’єднанням окисного фосфорилювання і розбухання мітохондрій, як наслідок, порушення їх функцій. Це важливо, оскільки, швидкість “виведення з дії” мітохондрій обмежує продукцію АТФ і, відповідно, завершення енергозалежного апоптозу, чи ж, при вичерпуванні “запасів” АТФ перехід клітинної загибелі з апоптичного шляху до некротичного (вторинний некроз).

4. Ядро. Внутрішньоядерні апоптичні процеси можна умовно поділити на дві окремі у часі групи:

а) перша пов’язана з активацією проапоптичних (індукуючих апоптоз) генів і біосинтезом відповідних апоптичних білків,

б) друга – міжнуклеосомальна фрагментація ДНК.

а) Основна мета внутрішньоклітинних шляхів реалізації апоптозу: активація геномних реакцій клітин, тобто необхідно викликати синтез та активацію й накопичення специфічних білків (а отже, “вімкнути” роботу генетичних послідовностей, що їх кодують), які й реалізуватимуть, здійснюватимуть подальші “біохімічні ” стадії апоптозу, - і як наслідок, відбуватимуться морфологічні зміни в клітинах, що підлягають апоптичній елімінації. В клітині існує два класи генів і відповідних білків: необхідних для протікання апоптозу і блокаторів апоптозу.

Гени, що регулюють апоптоз

Гальмівні Bcl-2 (шляхи дії досліджуються) P53-мутант (в пухлинах), C FES

Стимулюючі р53 (регулятор транскрипції, репарації і реплікації ДНК, утворюється постійно, але швидко деградує. Лише при пошкодженні ДНК його деградація припняється і він індукує зупинку клітинного циклу); BAX, BAK, BAD – активуються р53, АРО-1/FAS ICE/ced-3 і ced-4 – гени цистеїнових протеаз

б) міжнуклеосомальна фрагментація ДНК є необоротною стадією апоптозу і відбувається з утворенням полідезоксирибонуклеотидів по 180-200 пар основ. В утворенні цих фрагментів ДНК беруть участь різні ядерні ферменти, а на більш пізніх стадіях цитозольні ферменти, це Ca²⁺,Mg²⁺–залежна ендонуклеаза, топоізомераза ІІ, протеолітичні ферменти, ДНКаза І, ДНКаза ІІ. Велике значення має концентрація іонів кальцію (чим їх більше тим інтенсивніше йде фрагментація).

Генетичні і молекулярні механізми апоптозу були вперше охарактеризовані в кінці 80-х на початку 90-х в дослідах на нематоді Caenorhabditis elegans. Досліди показали, що апоптоз складається з 4 послідовних етапів:

1) поштовх до апоптичної загибелі внутрішньо- чи зовнішньоклітинними тригерами і “увімкнення” генетичних програм апоптозу (вірніш, зрушення рівноваги апопозіндуктори – апоптозінгібітори в бік апоптозіндукторів);

2) клітинна екзекуція шляхом активації внутрішньоклітинних протеаз;

3) поглинання залишків клітини іншими клітинами;

4) деградація клітинних залишків за участі лізосом фагоцитарних клітин.

Таким чином, в геномі будь-якої клітини є гени, що реагують на дію індукторів чи інгібіторів апоптозу і, відповідно, є активаторами чи блокаторами цього процесу.

ІНДУКТОРИ АПОПТОЗУ

(ПРОАПОПТИЧНІ ФАКТОРИ).

Фактори, що індукують апоптоз:

1. Фізіологічні фактори, що індукують апоптоз: глюкокортикоїди, FasR-FasL-взаємодія, цитокіни (фактори некрозу пухлин - ТNF), нейротрансмітери (глутамат, допамін), презентація антигену (аутоантигенів).

2. Нестача факторів, що забезпечують життєздатність або інгибуючих апоптоз факторів: відсутність ростових факторів, порушення адгезії).

3. Випадкові фактори: токсини, ліки, опромінення, підвищення температури, активні форми кисню, оксид азоту, ішемія, нестача живлення, бактеріальні й вірусні інфекції.

4. Порушення метаболізму або клітинного циклу: генетична або набута ферментопатія, порушення живлення (харчування).

Індукторні сигнали, що викликають апоптоз, можуть опосередковувати свою дію через рецепторні системи, далі сигналпередаючих внутрішньоклітинних систем. Характер відповіді клітини залежить, зокрема, від стану внутрішньоклітинних процесів, таких як, наприклад, система репарації ДНК. Так, дія гуморальних факторів (гормони, цитокіни, петидні ростові фактори) є неоднозначною, для одних клітин (тканин) вони можуть виступати індукторами апоптозу, для інших – інгібіторами. Це залежить від типу клітин, стадії їх диференціювання, функціонального стану.

ІНГІБІТОРИ АПОПТОЗУ

(АНТИАПОПТИЧНІ ФАКТОРИ).

Антиапоптична дія:

- антиоксиданти, тобто пригнічення процесів перекисного окислення ліпідів, інтенсивність якого має істотне значення для апоптозу;

- регуляція потоків кальцію через мембрани ендоплазматичного ретикулуму; Іони цинку протидіють Ca²⁺,Mg²⁺–залежній ендонуклеазі.

- припускають, що білки – продукти bcl-2 димеризуються з білками з проапоптичною дією і інактивують останні, можлива роль фосфорилювання білків.
5. ПОРІВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА АПОПТОЗУ І НЕКРОЗУ.

Некроз – метаболічна катастрофа Причиною некрозу є пряма дія патогенного фактору (мікроорганізми, ішемія, фізичний вплив). Процес неспецифічний. Морфологічні прояви: порушення функцій мембран і мембранних іонних каналів. Порушення окисно-відновних процесів і синтезу АТФ – енергодефіцит. Порушення цілісності плазматичної мембрани та мембран призводить до вивільнення лізосомальних ферментів. В ядрі: каріопікноз (конденсація хроматину), каріорексис (розпад хроматину на глибки), каріолізіс (розчинення). В цитоплазмі: денатурація і коагуляція білків. Клітинна мембрана руйнується. Масовий викид в навколишнє середовище індукторів запалення. Процес генералізується, вражаються сусідні клітини. Міграція імунокомпетентних клітин до місця запалення. Рештки клітин, що розпались поглинаються макрофагами. Формується сполучнотканинний рубець.

Апоптоз – програмована загибель клітини Фактором ініціації апоптозу є зростання експресії генів – індукторів апоптозу, або пригнічення генів-інгібіторів та збільшення надходження іонів кальцію у клітину. Це активний специфічний процес. Синтезуються білки – індуктори апоптозу. Морфологічні прояви: різко окреслене ущільнення ядерного хроматину (конденсація), зміщення його до периферії ядра, далі розпад ядра на дискретні фрагменти; поступове зникнення міжклітинних контактів. Перетворення клітини на сукупність оточених мембраною фрагментів. Біохімічні прояви: фрагментація ДНК, збільшення проникності плазматичної мембрани. Мембрани мітохондрій зберігаються, але відбувається поступове порушення окисно-відновних процесів. Зростає синтез протеаз, які розщеплюють внутрішньоклітинні структури. Клітинна мембрана зберігається. Клітина розпадається на фрагменти – апоптичні тільця оточенібішаровими мембранами, які фагоцитуються тканевими макрофагами й сусідніми клітинами без розвитку запалення і формування сполучної тканини. Немає запалення, немає порушення нормального функціонування сусідніх клітин, немає сполучнотканинного заміщення, тому зберігається структура тканини й органу.