Техника нанесения исследуемых растворов

 

Нанесение исследуемого вещества не такая сложная операция, но вместе с тем, она очень влияет на получаемые результаты хроматографирования.

Наиболее важным является концентрация наносимых веществ. В ТСХ принято наносить концентрации растворов около 1%. Но с другой стороны чувствительность метода позволяет определять вещества с гораздо меньшими концентрациями.

Нанесение пятен проводят на "линии старта" 0,5 см от нижнего края пластинки. Это необходимо для того, чтобы при опускании пластинки в систему не происходило растворение в ней образцов, а все нанесенное вещество подверглось хроматографированию.

Нанесение растворов проводят либо микрошприцом, либо капиллярами. Диаметр наносимого пятна не должен превышать 4 мм. Это связано с тем, что при большем размере пятна, происходит изменение формы под действием физических сил, да и границы разделенных компонентов могут перекрываться.

Нанесение на пластины исследуемых веществ не должны сопровождаться разрушением сорбента (что довольно сильно влияет на качество разделения), поэтому капля должна наноситься касанием иглы или капилляра о слой сорбента, а не надавливанием.

Расстояние между наносимыми пятнами должно быть около 1 см.

После нанесения исследуемых веществ на пластинку, необходимо добиться полного удаления растворителей, так как даже небольшое содержание растворителя в исследуемом веществе может повлиять на разделение и даже изменить состав хроматографической системы.

Удаление растворителей обычно проводят естественной сушкой пластин либо при нагревании в сушильном шкафу.

 

 

Хроматографирование

 

Тонкослойная хроматография имеет несколько способов, связанных, в основном, с видом движения растворителей:

- восходящая тонкослойная хроматография;

- нисходящая тонкослойная хроматография;

- горизонтальная тонкослойная хроматография;

- радиальная тонкослойная хроматография.

В данной лабораторной работе мы будем использовать восходящую тонкослойную хроматографию.

 

Восходящая тонкослойная хроматография

 

Этот вид хроматографии наиболее распространен и основан на том, что фронт хроматографической системы поднимается по пластинке под действием капиллярных сил, т.е. фронт хроматографической системы движется снизу-вверх. Для этого метода используется наиболее простое оборудование, так как в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка.

Метод восходящей тонкослойной хроматографии имеет ряд своих недостатков. Например, скорость поднятия фронта по пластинке происходит неравномерно, т.е. в нижней части она самая высокая, а по мере поднятия фронта уменьшается. Это связано с тем, что в верхней части камеры насыщенность парами растворителя меньше, поэтому растворитель с хроматографической пластинки испаряется интенсивнее, следовательно уменьшается его концентрация и скорость движения замедляется.

Недостатком также можно считать необходимость следить за фронтом растворителя, так как возможно "убегание" линии фронта растворителя до верхнего края. В таком случае определить действительное значение R_f уже не представляется возможным.

 

Значение R_f

 

Высушенная пластинка является хроматограммой исследуемых веществ.Одним из основных показателей в ТСХ является показатель R_f. Этот параметр является аналогией времени удерживания и зависит как от свойств разделяемых веществ, состава подвижной фазы и сорбента, так и от физических параметров.

Определение значения R_f проводят как отношение расстояния прошедшего веществом к расстоянию, прошедшего фронтом растворителя:

Значение R_f - величина безразмерная и имеет значение от 0 до 1.

На значение R_f не влияет расстояние пройденное фронтом растворителя.

На практике, в начале определяют расстояние прошедшее фронтом растворителя: от линии старта (а не от края пластинки) до места, где находился фронт в момент окончания хроматографирования (линия финиша). Затем определяют расстояние от линии старта до пятна разделенного вещества (до центра этого пятна). Во тут и оказывает влияние размер пятна! Ведь если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то полученное R_f имеет четкое значение. А если полученное пятно имеет большой размер или неправильную форму, то при определении R_f такого пятна, ошибка может достигнуть 0,1!

Цель работы: на примере кислотного гидролиза крахмала изучить процесс последовательной деполимеризации полисахарида. Провести хроматографический анализ гидролизата, идентифицировать продукты гидролиза.

 

Реактивы и оборудование:

1) крахмальный клейстер;

2) 10%-ный раствор серной кислоты;

3) 0,1 н раствор йода в KI;

4) пластинки «Силуфол» для ТСХ;

5) разделяющая система растворителей;

6) реагент для проявления пластинок;

7) вода дистиллированная;

8) стаканы химические на 50 мл;

9) штатив с калиброванными пробирками на 10 мл;

10) пипетки;

11) стеклянная палочка;

12) хроматографическая камера;

13) термостат;

14) весы лабораторные;

15) мерный цилиндр на 25 мл.

Порядок выполнения работы.

Опыт 1. Приготовление крахмального клейстера.

В химическом стакане растворяют 1,5 г крахмала в 25 мл дистиллированной воды и доводят до кипения при интенсивном перемешивании стеклянной палочкой.

 

Опыт 2. Гидролиз крахмала.

При нагревании крахмала с разбавленными кислотами происходит его гидролиз по следующей схеме:

(С₆Н₁₀О₅)_х ® (С₆Н₁₀О₅)_y® С₁₂Н₂₂О₁₁® С₆Н₁₂О₆

крахмал декстрины мальтоза глюкоза

где у < х.

 

В мерную пробирку помещают 2 мл крахмального клейстера и 6 капель раствора серной кислоты. Содержимое пробирки встряхивают и ставят в стакан на 50 мл с кипящей водой. Каждые 2 минуты отбирают пипеткой каплю раствора и переносят в пробирку с раствором йода. Для этого предварительно в 8 пробирок помещают по одной капле раствора йода и 5 капель воды.

Последовательные пробы обнаруживают постепенное изменение окраски при реакции с йодом (синюю, сине-фиолетовую, красно-фиолетовую, красновато-оранжевую, оранжевую и желтую).

Крахмал с йодом дает синее окрашивание. Декстрины, в зависимости от величины цепочки, с йодом окрашиваются в фиолетовые, красные и оранжевые цвета. Мальтоза и глюкоза не изменяют окраски йода.

Гидролиз крахмала заканчивают, когда крахмальный клейстер не будет давать цветной реакции с йодом. Отмечают общую продолжительность гидролиза.

По окончании гидролиза проводят анализ реакционной среды методом ТСХ.

Опыт 3. Метод ТСХ.

На подготовленную пластинку для ТСХ «Силуфол» с помощью хроматографического шприца или капилляра наносят гидролизат в виде точки, рядом (с обеих сторон от точки гидролизата) наносят пробы свидетелей – раствор мальтозы и раствор глюкозы (при проведении исследований веществ с предполагаемым составом, применяют метод хроматографирования со свидетелем - известным веществом). Линию финиша отмечают, отступив 5 мм от верхнего края пластинки.

 

L =а-в (смотри рисунок), L0 =а-б (смотри рисунок).   Рисунок 1. Хроматограмма. Линия а-а – линия старта, б-б – линия фронта растворителя (линия финиша), в – линии, отвечающие центру пятен вещества. А –точка нанесения раствора глюкозы; Б – точка нанесения раствора гидролизата; В – точка нанесения раствора мальтозы.

Пластинку вертикально помещают в камеру, которая заполнена разделяющей смесью до высоты 5 мм. Состав разделяющей смеси: н -бутанол – уксусная кислота – вода (60 мл – 15 мл – 25 мл). Пластинку выдерживают в камере до тех пор, пока высота подъема фронта восходящего растворителя не достигнет отмеченной длины разделительного пути (линия финиша).

По окончании хроматографического разделения пластинку вынимают из камеры и сушат при комнатной температуре в вытяжном шкафу до полного испарения остатков растворителей.

Затем разделение повторяют в той же системе растворителей. Высушенные пластинки погружают в реагент, представляющий собой смесь: н -бутанол –водоуксусная кислота – фосфорная кислота – анилин – дифениламин (60 мл – 25 мл – 15 мл – 10 мл – 1 мл – 2 г). Пластинки снова сушат и проявляют в термостате при температуре 120⁰С в течение 5 мин.

Идентификацию продуктов гидролиза проводят с помощью свидетелей и по значениям R_f. Данные заносят в таблицу 3.

 

Таблица 3.

№ п/п	Название компонента смеси	Rf	Цвет пятна
	Декстрины
	Мальтоза
	Глюкоза

Контрольные вопросы.

1. Роль моно-, олиго- и полисахаридов в пищевых продуктах.

2. Кислотный гидролиз крахмала. Какие продукты образуются при гидролизе? Недостатки кислотного гидролиза. Схема реакции. Формула крахмала.

3. Гидролиз крахмала амилолитическими ферментами: a- и b-амилазами, глюкозоамилазой. Особенности ферментативного гидролиза крахмала.Схема реакции. Формула крахмала

4. На чем основано хроматографическое разделение смеси веществ? Что такое элюент? Как рассчитывается величина R_f?

5. Приведите классификацию углеводов. Напишите формулы для каждой приведенной Вами группы.

6. Пищевая и энергетическая ценность углеводов.

7. Реакция Майяра. Начальная стадия.

8. Реакция Майяра. Перегруппировка Амадари.

9. Реакция Майяра. Образование дифруктозоглицина.

10. Образование 3-дезоксиглюкозона.

11. Реакция карамелизации.

12. Образование оксиметилфурфурола.

 

Лабораторная работа №3