Техника нанесения исследуемых растворов



Мы поможем в написании ваших работ!


Мы поможем в написании ваших работ!



Мы поможем в написании ваших работ!


ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Техника нанесения исследуемых растворов



 

Нанесение исследуемого вещества не такая сложная операция, но вместе с тем, она очень влияет на получаемые результаты хроматографирования.

Наиболее важным является концентрация наносимых веществ. В ТСХ принято наносить концентрации растворов около 1%. Но с другой стороны чувствительность метода позволяет определять вещества с гораздо меньшими концентрациями.

Нанесение пятен проводят на "линии старта" 0,5 см от нижнего края пластинки. Это необходимо для того, чтобы при опускании пластинки в систему не происходило растворение в ней образцов, а все нанесенное вещество подверглось хроматографированию.

Нанесение растворов проводят либо микрошприцом, либо капиллярами. Диаметр наносимого пятна не должен превышать 4 мм. Это связано с тем, что при большем размере пятна, происходит изменение формы под действием физических сил, да и границы разделенных компонентов могут перекрываться.

Нанесение на пластины исследуемых веществ не должны сопровождаться разрушением сорбента (что довольно сильно влияет на качество разделения), поэтому капля должна наноситься касанием иглы или капилляра о слой сорбента, а не надавливанием.

Расстояние между наносимыми пятнами должно быть около 1 см.

После нанесения исследуемых веществ на пластинку, необходимо добиться полного удаления растворителей, так как даже небольшое содержание растворителя в исследуемом веществе может повлиять на разделение и даже изменить состав хроматографической системы.

Удаление растворителей обычно проводят естественной сушкой пластин либо при нагревании в сушильном шкафу.

 

 

Хроматографирование

 

Тонкослойная хроматография имеет несколько способов, связанных, в основном, с видом движения растворителей:

- восходящая тонкослойная хроматография;

- нисходящая тонкослойная хроматография;

- горизонтальная тонкослойная хроматография;

- радиальная тонкослойная хроматография.

В данной лабораторной работе мы будем использовать восходящую тонкослойную хроматографию.

 

Восходящая тонкослойная хроматография

 

Этот вид хроматографии наиболее распространен и основан на том, что фронт хроматографической системы поднимается по пластинке под действием капиллярных сил, т.е. фронт хроматографической системы движется снизу-вверх. Для этого метода используется наиболее простое оборудование, так как в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка.

Метод восходящей тонкослойной хроматографии имеет ряд своих недостатков. Например, скорость поднятия фронта по пластинке происходит неравномерно, т.е. в нижней части она самая высокая, а по мере поднятия фронта уменьшается. Это связано с тем, что в верхней части камеры насыщенность парами растворителя меньше, поэтому растворитель с хроматографической пластинки испаряется интенсивнее, следовательно уменьшается его концентрация и скорость движения замедляется.

Недостатком также можно считать необходимость следить за фронтом растворителя, так как возможно "убегание" линии фронта растворителя до верхнего края. В таком случае определить действительное значение Rf уже не представляется возможным.

 

Значение Rf

 

Высушенная пластинка является хроматограммой исследуемых веществ.Одним из основных показателей в ТСХ является показатель Rf. Этот параметр является аналогией времени удерживания и зависит как от свойств разделяемых веществ, состава подвижной фазы и сорбента, так и от физических параметров.

Определение значения Rf проводят как отношение расстояния прошедшего веществом к расстоянию, прошедшего фронтом растворителя:

Значение Rf - величина безразмерная и имеет значение от 0 до 1.

На значение Rf не влияет расстояние пройденное фронтом растворителя.

На практике, в начале определяют расстояние прошедшее фронтом растворителя: от линии старта (а не от края пластинки) до места, где находился фронт в момент окончания хроматографирования (линия финиша). Затем определяют расстояние от линии старта до пятна разделенного вещества (до центра этого пятна). Во тут и оказывает влияние размер пятна! Ведь если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то полученное Rf имеет четкое значение. А если полученное пятно имеет большой размер или неправильную форму, то при определении Rf такого пятна, ошибка может достигнуть 0,1!

Цель работы:на примере кислотного гидролиза крахмала изучить процесс последовательной деполимеризации полисахарида. Провести хроматографический анализ гидролизата, идентифицировать продукты гидролиза.

 

Реактивы и оборудование:

1) крахмальный клейстер;

2) 10%-ный раствор серной кислоты;

3) 0,1 н раствор йода в KI;

4) пластинки «Силуфол» для ТСХ;

5) разделяющая система растворителей;

6) реагент для проявления пластинок;

7) вода дистиллированная;

8) стаканы химические на 50 мл;

9) штатив с калиброванными пробирками на 10 мл;

10) пипетки;

11) стеклянная палочка;

12) хроматографическая камера;

13) термостат;

14) весы лабораторные;

15) мерный цилиндр на 25 мл.

Порядок выполнения работы.

Опыт 1. Приготовление крахмального клейстера.

В химическом стакане растворяют 1,5 г крахмала в 25 мл дистиллированной воды и доводят до кипения при интенсивном перемешивании стеклянной палочкой.

 

Опыт 2. Гидролиз крахмала.

При нагревании крахмала с разбавленными кислотами происходит его гидролиз по следующей схеме:

6Н10О5)х ® (С6Н10О5)y® С12Н22О11® С6Н12О6

крахмал декстрины мальтоза глюкоза

где у < х.

 

В мерную пробирку помещают 2 мл крахмального клейстера и 6 капель раствора серной кислоты. Содержимое пробирки встряхивают и ставят в стакан на 50 мл с кипящей водой. Каждые 2 минуты отбирают пипеткой каплю раствора и переносят в пробирку с раствором йода. Для этого предварительно в 8 пробирок помещают по одной капле раствора йода и 5 капель воды.

Последовательные пробы обнаруживают постепенное изменение окраски при реакции с йодом (синюю, сине-фиолетовую, красно-фиолетовую, красновато-оранжевую, оранжевую и желтую).

Крахмал с йодом дает синее окрашивание. Декстрины, в зависимости от величины цепочки, с йодом окрашиваются в фиолетовые, красные и оранжевые цвета. Мальтоза и глюкоза не изменяют окраски йода.

Гидролиз крахмала заканчивают, когда крахмальный клейстер не будет давать цветной реакции с йодом. Отмечают общую продолжительность гидролиза.

По окончании гидролиза проводят анализ реакционной среды методом ТСХ.

Опыт 3. Метод ТСХ.

На подготовленную пластинку для ТСХ «Силуфол» с помощью хроматографического шприца или капилляра наносят гидролизат в виде точки, рядом (с обеих сторон от точки гидролизата) наносят пробы свидетелей – раствор мальтозы и раствор глюкозы (при проведении исследований веществ с предполагаемым составом, применяют метод хроматографирования со свидетелем - известным веществом). Линию финиша отмечают, отступив 5 мм от верхнего края пластинки.

 

  L=а-в (смотри рисунок), L0=а-б (смотри рисунок).   Рисунок 1. Хроматограмма. Линия а-а – линия старта, б-б – линия фронта растворителя (линия финиша), в – линии, отвечающие центру пятен вещества. А –точка нанесения раствора глюкозы; Б – точка нанесения раствора гидролизата; В – точка нанесения раствора мальтозы.  

Пластинку вертикально помещают в камеру, которая заполнена разделяющей смесью до высоты 5 мм. Состав разделяющей смеси: н-бутанол – уксусная кислота – вода (60 мл – 15 мл – 25 мл). Пластинку выдерживают в камере до тех пор, пока высота подъема фронта восходящего растворителя не достигнет отмеченной длины разделительного пути (линия финиша).

По окончании хроматографического разделения пластинку вынимают из камеры и сушат при комнатной температуре в вытяжном шкафу до полного испарения остатков растворителей.

Затем разделение повторяют в той же системе растворителей. Высушенные пластинки погружают в реагент, представляющий собой смесь: н-бутанол –водоуксусная кислота – фосфорная кислота – анилин – дифениламин (60 мл – 25 мл – 15 мл – 10 мл – 1 мл – 2 г). Пластинки снова сушат и проявляют в термостате при температуре 1200С в течение 5 мин.

Идентификацию продуктов гидролиза проводят с помощью свидетелей и по значениям Rf. Данные заносят в таблицу 3.

 

Таблица 3.

№ п/п Название компонента смеси Rf Цвет пятна
Декстрины    
Мальтоза    
Глюкоза    

Контрольные вопросы.

1. Роль моно-, олиго- и полисахаридов в пищевых продуктах.

2. Кислотный гидролиз крахмала. Какие продукты образуются при гидролизе? Недостатки кислотного гидролиза. Схема реакции. Формула крахмала.

3. Гидролиз крахмала амилолитическими ферментами: a- и b-амилазами, глюкозоамилазой. Особенности ферментативного гидролиза крахмала.Схема реакции. Формула крахмала

4. На чем основано хроматографическое разделение смеси веществ? Что такое элюент? Как рассчитывается величина Rf?

5. Приведите классификацию углеводов. Напишите формулы для каждой приведенной Вами группы.

6. Пищевая и энергетическая ценность углеводов.

7. Реакция Майяра. Начальная стадия.

8. Реакция Майяра. Перегруппировка Амадари.

9. Реакция Майяра. Образование дифруктозоглицина.

10. Образование 3-дезоксиглюкозона.

11. Реакция карамелизации.

12. Образование оксиметилфурфурола.

 


Лабораторная работа №3



Последнее изменение этой страницы: 2016-04-26; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.236.68.118 (0.009 с.)