Занятие 3. Детекция продуктов амплификации

Является финальной стадией ПЦР. Для детекции амплифицированных фрагментов ДНК используется метод горизонтального электрофореза в агарозном геле с использованием трис-боратного буфера. Для того, чтобы визуально обнаружить ДНК-фрагменты в трис-боратный буфер добавляют бромистый этидий^*. Это вещество способно встраиваться в двухцепочечные молекулы ДНК и флуоресцировать под ультрафиолетовыми лучами^**. Именно флуоресцирующие ДНК-фрагменты являются целью исследователя, применяющего ПЦР-метод (фото 7). При помощи цифрового фотоаппарата ДНК-фрагменты записываются и могут быть проанализированы.

 

^* Бромистый этидий – сильный канцероген, способный проникать через кожу в организм (рис. 4). Следует уделять особое внимание при работе с ним. Для работы с бромистым этидием используются перчатки.

 

Рис. 4. Химическое строение бромистого этидия

^**Ультрафиолетовые лучи опасны для глаз. Поэтому при работе с ультрафиолетовой лампой нужно избегать прямого попадания лучей в глаза и использовать защищающие глаза специальные очки или маски. Материалом для очков и масок может служить стекло с примесями окиси железа(Fe₂O₃), например, оконное стекло (0. 1 % Fe₂O₃).

Для этапа детекции продуктов амплификации используются следующие химические вещества:

1. агароза;

2. трис-боратный буфер^*;

3. бромистый этидий;

4. маркер молекулярных весов.

 

*Трис-боратный буфер можно приготовить самостоятельно.

Необходимы следующие химические вещества:

Трис-(оксиметил)-аминометан – 10.78 г,

Борная кислота – 5.503 г,

EDTA, pH 8.0 – 4.384 мл,

дистиллят – 86.3 мл,

бромистый этидий – 10-15 мкл (10 мг/мл).

Смешать химические вещества и размешать до полного растворения. Довести дистиллятом объем раствора до литра. Хранить трис-боратный буфер нужно при температуре 18-25 ^оС.

 

Порядок работы.

1. Приготовить 1.8%-ный агарозный гель на основе трис-боратного буфера. Поместить его в камеру для электрофореза.

2. Залить гель трис-боратным буфером, содержащим бромистый этидий.

3. Нанести по 5 мкл каждой пробы в отдельные лунки. Нанести в отдельную лунку маркер.

4. Подключить камеру для электрофореза к источнику электрического питания (50 mA, 100 V).

 

Через 30-70 минут после начала электрофореза достать гель и сфотографировать его под ультрафиолетовой лампой, используя специальные очки для защиты глаз (фото 7).

Количество наработанных фрагментов ДНК определяют качество визуальной детекции ампликонов. Сколько же нужно ампликонов одного фрагмента ДНК для визуальной детекции? Для фрагмента ДНК длиной от 100 до 200 п. н. достаточно 10^8–10⁹ двухцепочечных ампликонов. Теоретически, это приблизительно 30 циклов ПЦР на ДНК, выделенной из одной клетки.

1 2 3 М

М-маркер (длина фрагментов от 100 до 1000 п. н.; шаг– 100 п. н.),

1, 2, 3 – фрагменты ДНК дуба пушистого.

 

Фото 7. Продукты амплификации ДНК дуба пушистого (OPA 14)

Чем меньше длина двухцепочечного ДНК-фрагмента, тем слабее он флуоресцирует. Это объясняется тем, что в короткий ДНК-фрагмент встраивается меньшее количество молекул бромистого этидия, чем в длинный.

Бромистый этидий обладает интересной особенностью, за которую его и начали использовать в ПЦР-методе. При встраивании бромистого этидия в двухцепочечную молекулу ДНК, его способность к флуоресценции возрастает в 20 раз. Максимум спектра поглощения бромистого этидия находится в области ультрафиолетовых лучей.

Статистическую обработку данных ПЦР-анализа можно проводить при помощи различных компьютерных программ:

Treecon for Windows (version 1.3 b), MAPMAKER 3.0, Граф-анализ и др.

 

Задание 3.1.

Провести детекцию продуктов амплификации ДНК комнатных растений (праймеры серии OPА).

Задание 3.2.

Провести детекцию продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (специфические праймеры).

 

 

Задачи и вопрoсы

1.Дана последовательность ДНК:

 

5’-A T C G C C G C A A C G A G A C G A C T G C G C A T C G T C T C G T T G C G – 3’

3’- T A G C G G C G T T G C T C T G C T G A C G C G T A G C A G A G C A A C G C - 5’.

 

В ходе ПЦР будет использоваться праймер со следующей последовательностью 5’-C G C A A C G A G A C-3’. Установите длину ампликона.

 

2. В ходе этапа выделения было получено ДНК 888 клеток. Был подобран праймер, который обусловливает амплификацию фрагмента ДНК длиной 500 п. н. Достаточно ли 29 циклов ПЦР для визуальной детекции данного фрагмента?

 

3. Дана последовательность ДНК:

 

5’-A T G C G G C A T T G G A G A C T C T C T G A G C A C T G C G C A T C G C A A -3’

3’-T A C G C C G T A A C C T C T G A G A G A C T C G T G A C G C G T A G C G T T -5’.

 

В ходе ПЦР могут быть использованы следующие праймеры:

а. 5’-G C G G C A T T G G-3’,

б. 5’-G A C T C T C T G A-3’,

в. 5’-T T G C GA T G C G- 3’,

г. 5’-A G A C T C T C T G-3’.

Отжиг каких пар праймеров даст продукты амплификации? Какой длины будут ампликоны, если смешать все праймеры?

 

4. Если бы Кэри Мюллис в 1983 году (25 декабря) запустил амплификацию одного фрагмента ДНК из одной клетки эпителия кожи, то сколько бы копий ампликона наработалось к сегодняшнему дню? Скорость ПЦР – 1 цикл в день.

 

5. В ходе ПЦР было получено 7 фрагментов разной длины. ДНК было выделено из 7 клеток. Использовался только один тип праймера. Сколько раз отжегся праймер в первом цикле ПЦР?

Сколько раз отжегся праймер во втором цикле ПЦР?

 

6. В ходе ПЦР образуется 1 фрагмент ДНК. ДНК была выделена из одной клетки. Полимеразная цепная реакция была прервана во время стадии денатурации ДНК 9-го цикла. Насколько уменьшилось количество свободных молекул праймера?

 

8. Во время детекции продуктов амплификации можно видеть, что некоторые ампликоны имеют разную толщину. Почему?

 

9. Почему для проведения ПЦР нельзя использовать

ДНК-полимеразу человека, растительное масло, обычную воду?

 

10. В ходе ПЦР амплифицируется 1 ДНК-фрагмент. ПЦР была прервана на 35 цикле (III стадия). В ходе ПЦР используется праймер 5’-C A T C A T C A T -3’. Какой будет длина ДНК-фрагмента, если объединить все молекулы праймера, которые успели отжечься к этому моменту?

 

11. Сколько нужно молекул праймера, чтобы амплифицировался 1 фрагмент ДНК в течение 26 циклов?

 

12. В составе генома человека приблизительно 3,2 миллиарда пар нуклеотидов. В ходе ПЦР амплифицируется фрагмент ДНК длиной 512 п.н. Сколько понадобится циклов ПЦР, чтобы сумма двухцепочечных ампликонов по количеству п. н. стала в 7 раз больше, чем геном человека?