Лекция 5. Применение пцр для разных видов научно-исследовательской работы

Использование ПЦР-метода обычно происходит в следующих двух типах ситуаций.

1. Используется специфические праймеры, которые будут отжигаться на определенном участке ДНК, заранее известном исследователю (фото 4). То есть, известны места отжига праймера и расстояния между сайтами отжига праймеров. Это может быть определенный ген, теломеры хромосом, палиндромы и т. д. Для того, чтобы знать последовательность определенного участка ДНК, нужно прежде провести секвенирование данного фрагмента. Когда последовательность установлена и подобран праймер, можно проводить ПЦР.

M F

М – маркер молекулярных весов ДНК от 200 до 1000 п.о. с шагом в 100 п.н., F – фрагмент вирусной ДНК длиной 317 п.н.

 

Фото 4. Продукт амплификации вирусной ДНК со специфическими праймерами, выделенной из полиэдров вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда

Специфические праймеры используется, например, в диагностике инфекционных заболеваний. Для этого подбирается (например, в GeneBank) и синтезируется праймер, который будет отжигаться только на ДНК определенного возбудителя заболевания.

2. Используется праймер (праймеры), который будет отжигаться случайно на ДНК. Такая разновидность ПЦР называется RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA, случайно амплифицированная ДНК). Часто используется для изучения генетического полиморфизма в популяциях. При этом невозможно предсказать точно ни длину наработанных фрагментов, ни их число (фото 5). Кроме этого, всегда существует вероятность, что используемый праймер не сработает. Поэтому перед началом исследований подбирают подходящий праймер.

1.1, 2.1,3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1 – исследовалась поверхность яиц на наличие вирусной ДНК; 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2 – исследовалось содержимое яиц на наличие вирусной ДНК; М – маркер молекулярных весов ДНК от 100 до 1000 п.о. с шагом в 100 п.о.; 00, 01, 02, 03 – условные зоны продуктов амплификации вирусной ДНК

 

Фото 5. Продукты амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза с поверхности и изнутри яиц непарного шелкопряда (праймер OPA-08)

 

Для примера смоделируем исследовательскую ситуацию. Например, существует организм А, на который действует фактор B (биотический или абиотический). Если произведено секвенирование генома организма А, найдены гены, отвечающие за взаимодействие с фактором B, подобраны праймеры к ним (генам), то лучше всего проводить исследование типа 1. Если отсутствует информация о геноме организма А (или ее очень мало), то проводиться исследование типа 2.

Далее (после ПЦР), например, в случае проведения исследования второго типа, в зависимости от полученных фрагментов ДНК, ведется поиск маркеров взаимодействия между организмом А и фактором B. Например, может оказаться, что наличие маркера длиной Х усиливает влияние фактора В на организм А, а наличие маркера длиной Y, наоборот, уменьшает это влияние.

Теоретически можно рассчитать максимальное количество ампликонов (A) разной длины, которые будут амплифицироваться (второй тип исследования). При этом надо знать длину исследуемой ДНК (D) и длину праймера (L).

Для большинства существующих праймеров минимальный возможный размер ампликона будет равен 2L. Математически это можно представить в следующем виде:

D = A(A – 1)/2 + 2LA + M,

где М – остаток ДНК, на которой отжиг праймера не способен привести к амплификации фрагмента ДНК с длиной A+1;

M < 2L + A.

Вероятность такого события (образования максимального количества ампликонов разной длины с учетом 4 различных гетероциклических оснований) может быть описана математически:

P = 4^-2LA.

Из этой формулы следует, что чем больше длина праймера, тем меньше вероятность амплификации фрагментов разной длины.

 

Лекция 6. Подбор праймеров

 

Концентрация праймеров обычно варьирует в пределах 0,1-1 мкМ. Более высокая концентрация праймеров может приводить к образованию неспецифических продуктов.

Праймеры подбирают с учетом следующих требований:

а) содержание оснований Г и Ц в праймере должно находиться в пределах 40-60 %;

б) основания Г и Ц должны быть равномерно распределены по всей длине праймера;

в) желательно чтобы на 3’-конце праймера находилось основание Г или Ц, так как это увеличивает эффективность ПЦР;

г) следует избегать наличия 3 и более оснований Г или Ц на 3’-конце праймера, поскольку это может приводить к ошибочному спариванию праймера с ГЦ-богатыми участками ДНК;

д) праймеры не должны формировать стабильных дуплексов сами на себя или друг с другом;

е) участки отжига должны быть уникальными, т.е. праймеры не должны иметь длинных комплементарных участков вне специфических мест отжига;

ж) температура плавления (Т_m) данной пары праймеров должна быть сходной и находиться в пределах 55-65 ^оС.

Для ориентировочного подсчета температуры плавления используют формулу:

 

Т_m = 2(А+Т) + 4(Г+Ц),

где А, Т, Г, Ц, – количество соответствующих нуклеотидов в праймере. Более точные результаты можно получить при использовании формулы:

Т_m = 81,5 + 16,6(lgM) + 0,41(%Г+Ц)–(600/L),

 

где М – ионная сила раствора (в молях/л), L – длина олигонуклеотида. Эта формула пригодна для олигонуклеотидов длиной 14-70 оснований (Сулимова и др., 2006).