Лекция 1. Смысл полимеразной цепной реакции (ПЦР)

В.В. Оберемок

Методические рекомендации

К применению ПЦР-метода

 

для студентов 5 курса дневной формы обучения

специальности 8. 070402

«биология»

образовательно-квалификационного уровня «магистр»

профессионального направления подготовки

0704 «биология»

и

для студентов 3 курса дневной формы обучения

специальности 6.070300

«биохимия»

образовательно-квалификационного уровня «бакалавр»

профессионального направления подготовки

0703 «химия»

 

 

Симферополь 2008

 

Рекомендовано к печати научно-методическим

советом ТНУ от 02.11.2006

протокол № 2

 

 

СОДЕРЖАНИЕ

 

Теоретическая часть (лекции)

Лекция 1. Смысл полимеразной цепной реакции (ПЦР).......4

Лекция 2. Оборудование для ПЦР-метода..............................7

Лекция 3. Организация ПЦР-лаборатории и

правила поведения в ней….......................................................9

Лекция 4. Типичные ошибки при использовании

ПЦР-метода..............................................................................11

Лекция 5. Применение ПЦР-метода для разных видов

научно-исследовательской работы.........................................12

Лекция 6. Подбор праймеров………………………………..15

Лекция 7. «Золотая середина» концентраций веществ в

ПЦР-смеси…………………………………………...…...…..16

 

Практическая часть (лабораторные занятия)

Занятие 1. Выделение ДНК....................................................18

Занятие 2. Амплификация ДНК..............................................21

Занятие 3. Детекция продуктов

амплификации ДНК (электрофорез)......................................24

 

Задачи и вопросы.....................................................................27

Краткий словарь терминов и

дополнительные сведения.......................................................29

Список рекомендуемой и цитируемой литературы………..34

Список рекомендуемых веб-сайтов…………………….…. 34

 

Лекция 1. Смысл полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР – полимеразная цепная реакция, в ходе которой амплифицируются определенные участки ДНК. ПЦР была изобретена американским ученым Кэри Мюллисом в 1983 году. Широкие возможности, сравнительная дешевизна и простота ПЦР позволили использовать этот метод генетического анализа в разных областях научных исследований. В основе ПЦР лежит естественный для клеток процесс репликации (рис. 1). Отличие ПЦР от репликации состоит в том, что ПЦР происходит in vitro и воспроизводит репликацию частично.

1- геликаза

2- топоизомераза

3- ДНК-полимераза

4- ДНК-полимераза

5- лигаза

6- фрагмент Оказаки (затравка)

7- нуклеотидтрифосфаты

8- ДНК

 

Рис. 1. Репликация ДНК

 

Основные компоненты реакции:

dNTP (нуклеотидтрифосфаты), Taq-полимераза, праймеры, Mg²⁺, ПЦР-буфер, деионизованная вода, исследуемая ДНК. Полимеразная цепная реакция делится на циклы. Каждый цикл состоит из нескольких стадий: денатурация, отжиг праймеров, наращивание (комплементарное достраивание) цепи. Для каждой стадии характерны своя температура и временной интервал. Количество ампликонов разной длины, образующихся в конце ПЦР, теоретически можно рассчитать, если знать места отжига праймеров. Классическим примером является отжиг одного праймера по одному разу на каждой из цепей ДНК. Необходимо, чтобы при этом 3'-концы праймеров были впереди по отношению друг к другу (рис.1). Два двухцепочечных фрагмента (ампликона), которые появляются в конце 3 цикла в этом примере, дадут через n циклов следующее количество копий: F = 2∙2ⁿ, где F-количество двухцепочечных фрагментов ДНК, а n - количество циклов.

 

Рис. 2. Амплификация ДНК (окончание на следующей странице)

P – праймер, ffffffff – наращиваемая цепь

 

Рис. 2. Амплификация ДНК

Действовать самовольно и наугад.

 

 

Лекция 6. Подбор праймеров

 

Концентрация праймеров обычно варьирует в пределах 0,1-1 мкМ. Более высокая концентрация праймеров может приводить к образованию неспецифических продуктов.

Праймеры подбирают с учетом следующих требований:

а) содержание оснований Г и Ц в праймере должно находиться в пределах 40-60 %;

б) основания Г и Ц должны быть равномерно распределены по всей длине праймера;

в) желательно чтобы на 3’-конце праймера находилось основание Г или Ц, так как это увеличивает эффективность ПЦР;

г) следует избегать наличия 3 и более оснований Г или Ц на 3’-конце праймера, поскольку это может приводить к ошибочному спариванию праймера с ГЦ-богатыми участками ДНК;

д) праймеры не должны формировать стабильных дуплексов сами на себя или друг с другом;

е) участки отжига должны быть уникальными, т.е. праймеры не должны иметь длинных комплементарных участков вне специфических мест отжига;

ж) температура плавления (Т_m) данной пары праймеров должна быть сходной и находиться в пределах 55-65 ^оС.

Для ориентировочного подсчета температуры плавления используют формулу:

 

Т_m = 2(А+Т) + 4(Г+Ц),

где А, Т, Г, Ц, – количество соответствующих нуклеотидов в праймере. Более точные результаты можно получить при использовании формулы:

Т_m = 81,5 + 16,6(lgM) + 0,41(%Г+Ц)–(600/L),

 

где М – ионная сила раствора (в молях/л), L – длина олигонуклеотида. Эта формула пригодна для олигонуклеотидов длиной 14-70 оснований (Сулимова и др., 2006).

 

Занятие 1. Выделение ДНК

Для этапа выделения ДНК используется, как правило, свежий биологический материал, в котором ДНК находится в целостном состоянии. Все факторы, которые приводят к разрыву ковалентных связей в исследуемой ДНК и загрязняют пробы чужеродной ДНК, обусловливают ошибки при проведении ПЦР и должны быть упразднены. К таковым, прежде всего, нужно отнести высокую температуру (40–50 ^оC и выше), электромагнитное излучение (ультрафиолет, рентгеновские лучи), радиационное излучение (α, β, γ-лучи), присутствие жизни на исследуемом материале (бактерии, грибы). Наиболее оптимальным местом хранения ДНК является морозильная камера. При температуре -5 – -20 ^оС ДНК в клетках может сохраняться достаточно длительное время, не разрушаясь. Для хранения материала в течение 1-2 суток используется холодильник (2-8 ^оC).

Для выделения ДНК лучше всего подходит ткань, где клетки активно делятся и растут.

Мертвая ткань и ткани опорно-трофической функции, где ДНК встречается в полуразрушенном состоянии, дают слабый выход ампликонов (фото 6).

M О

М – маркер молекулярных весов ДНК (длина фрагментов от 100 до 1000 п. н. с шагом в 100 п. н.)

О – отсутствие продуктов амплификации ДНК

Фото 6. Отрицательная ПЦР-реакция (праймер OPA 14) с ДНК, выделенной из плавников пеленгаса

Объем материала, необходимый для выделения достаточного количества ДНК, зависит от размера клеток. Чем меньше размер клеток, тем меньше необходимо исследуемого вещества. Если ПЦР состоит из 40 циклов, то теоретически достаточно и одной клетки для того, чтобы обнаружить наработанные ДНК-фрагменты. Чем меньше исследуемого материала (количества клеток), тем аккуратней нужно проводить исследование, чтобы не загрязнить пробу.

При выделении ДНК используются стандартные наборы реактивов. Например, комплект «ДНК-сорб-А» фирмы «АмплиСенс» (Москва, Россия) для выделения ДНК, который имеет следующий состав:

1. лизирующий раствор;

2. отмывочный раствор;

3. сорбент универсальный;

4. ТЕ-буфер для элюции ДНК.

Хранится набор при температуре 2-25 ^оС. Рассчитан на выделение ДНК из 100 проб.

 

Порядок работы.

1. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок. Промаркировать пробирки.

2. Растереть пробы в ступке с добавлением 100 мкл дистиллята и перенести пробы по отдельным пробиркам.

3. Лизирующий раствор (если он хранился при 2-8 ^оС) прогреть при 65 ^оС до полного растворения кристаллов. В пробирки добавить по 300 мкл лизирующего раствора.

4. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65 ^оС. Процентрифугировать 5 с при 5 тыс. об/мин на центрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс. об/мин и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.

5. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 20 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе, поставить в штатив (планшет) на 2 минуты, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 минут.

6. Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удалить супернатант, используя дозатор с переменным объемом и меняя наконечник для каждой пробирки.

7. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге.

8. Удалить супернатант, используя дозатор с переменным объемом и меняя наконечник для каждой пробирки.

9. Повторить отмывку еще раз, следуя пункту 8., удалить супернатант полностью.

10. Поместить пробирки в термостат при 65 ^оС на 5-10 мин для подсушивания сорбента (осадок приобретает цвет мела). При этом крышки пробирок должны быть открыты.

11. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Переместить в термостат при 65 ^оС на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

12. Процентрифугировать пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Супернатант содержит очищенную ДНК, пробы готовы к постановке ПЦР.

 

Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при 2-8 ^оС и в течение 1 года при минус 20 ^оС. Эффективность выделения ДНК составляет 50-70 %.

 

Задание 1.1.

Выделить ДНК из листьев комнатных растений.

Задание 1.2.

Выделить ДНК из полиэдров вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.

 

Занятие 2. Амплификация ДНК

 

Основой данного этапа ПЦР является программируемый амплификатор. Амплификатор в зависимости от стадии изменяет температурный режим пробирок и временной интервал.

Амплификация ДНК включает в себя 3 стадии*:

1. денатурация ДНК (0,5-1 минута, 93 ^оС),

2. отжиг праймеров (0,5-1 минута, 35-40 ^оС),

3. наращивание цепи (1 минута, 72 ^оС).

*Температура и продолжительность цикла подходят для праймеров типа OPA.

Амплификация фрагмента определенной длины, который образуется при классическом отжиге праймера, изображенном на рис. 2, происходит по следующей математической формуле:

F = 2(n-1) + 2²(n-2) + 2³(n-3) + 2⁴(n-4) + 2⁵(n-5) +... +2^n-1 (a) ,

где n – количество циклов, F – количество одноцепочечных фрагментов в начале цикла n+1 (денатурация).

Количество нарабатываемых двухцепочечных фрагментов описывается следующей математической формулой:

F= 2 ¹(n-2) + 2²(n-3) + 2³(n-4) + 2⁴(n-5) + 2⁵(n-6) +... +2^n-2 (b),

где n- количество циклов, F-количество двухцепочечных фрагментов.

Рассмотрим значения формулы b для каждого цикла:

1-й цикл – –

2-й цикл – 0

3-й цикл – 2n-4

4-й цикл – 6n-16

5-й цикл – 14n-48 и т. д.

Каждое значение фрагментов для любого цикла можно представить в следующем виде:

(2^n-1-2)n – (2^n-1-2)(n-2) – 2(n-2) = F,

2(2^n-1-2) – 2(n-2) = F,

 

2(2^n-1 - n) = F.

 

Количество ампликонов с каждым циклом(n) увеличивается почти в два раза. При n→ ∞ это можно записать в следующем виде:

 

lim 2^n-1 – 2(n – 1)/ 2ⁿ – 2n = 1/2

n→ ∞

Для проведения данного этапа ПЦР (амплификации) используют разные приемы. Рассмотрим два из них.

1. «Горячий старт» («hot start») – прием, при котором пробирки с реагентами помещаются в амплификатор, нагретый до температуры 93-94 ^оС. Денатурация ДНК 1-го цикла должна протекать 2-2,5 минуты. Остальные циклы протекают согласно описанным выше температурным и временным константам. Данный прием позволяет избежать неспецифического отжига праймеров. Существуют разные модификации данного приема (например, с использованием воска).

2. Обычный прием предусматривает помещение пробирок в амплификатор при комнатной температуре. После достижения амплификатором температуры в 94 ^оС начинается процесс денатурации и т. д.

Для проведения этапа амплификации ДНК используются стандартные наборы реактивов. Примером может служить набор «АмплиСенс – 200 -1» фирмы «АмплиСенс» (Москва, Россия). В его состав входят:

1. смесь нуклеотидтрифосфатов, 2 mM;

2. 5-кратный реакционный буфер, без Mg²⁺;

3. сульфат магния, 50 mM;

4. деионизованная вода, стерильная, автоклавированная;

5. Taq-полимераза, 5 ед/мкл;

6. воск для ПЦР, 14%-ный, плавление при 37 ^оС;

7. минеральное масло, вазелиновое;

8. исследуемая ДНК.

Такой набор рассчитан на 200 реакций в объеме 25 мкл. Хранится набор при температуре 2-8 ^оС.

Смешивание реактивов проводится в такой пропорции (возможны вариации):

 

1. смесь нуклеотидтрифосфатов – 2,5 мкл;

2. 5-кратный реакционный буфер – 5 мкл;

3. сульфат магния – 1,5 мкл;

4. деионизованная вода – 3 мкл;

5. Taq-полимераза – 0,5 мкл;

6. минеральное масло – 11,5 мкл;

7. исследуемая выделенная ДНК – 5мкл;

8. праймер – 1 мкл.

Общий объем: 30 мкл.

Амплификация ДНК длится приблизительно 2,5 – 3,5 часа (30-40 циклов).

Количество праймера, необходимое для амплификации одного ДНК-фрагмента с одной молекулы ДНК в течение n циклов (рис. 2), описывается математической формулой:

P=2ⁿ⁺¹ – 2, где n - количество циклов, а Р - количество молекул праймера.

 

Порядок работы.

1. Промаркировать пробирки.

2. Смешать реактивы, исследуемую ДНК и праймер в пропорции описанной выше. Процентрифугировать на вортексе в течение 1 минуты, чтобы на стенках пробирок не осталось реагентов.

3. Выбрать подходящую программу на амплификаторе, загрузить пробирки в амплификатор и запустить амплификацию.

4. По окончанию амплификации можно приступать к 3-му этапу ПЦР (детекции продуктов амплификации).

Пробирки с наработанными фрагментами ДНК можно хранить при температуре 2-8 ^оС в течение двух недель.

 

Задание 2.1.

Провести амплификацию ДНК, выделенной из листьев комнатных растений с использованием праймеров серии OPA.

Задание 2.2.

Провести амплификацию ДНК, выделенной из полиэдров вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда со специфическими праймерами: а) 5’- GCC GGC GGA ACT GGC CCA -3’, б) 5’- CGA CGT GGT GGC ACG GCG -3’.

Задачи и вопрoсы

1.Дана последовательность ДНК:

 

5’-A T C G C C G C A A C G A G A C G A C T G C G C A T C G T C T C G T T G C G – 3’

3’- T A G C G G C G T T G C T C T G C T G A C G C G T A G C A G A G C A A C G C - 5’.

 

В ходе ПЦР будет использоваться праймер со следующей последовательностью 5’-C G C A A C G A G A C-3’. Установите длину ампликона.

 

2. В ходе этапа выделения было получено ДНК 888 клеток. Был подобран праймер, который обусловливает амплификацию фрагмента ДНК длиной 500 п. н. Достаточно ли 29 циклов ПЦР для визуальной детекции данного фрагмента?

 

3. Дана последовательность ДНК:

 

5’-A T G C G G C A T T G G A G A C T C T C T G A G C A C T G C G C A T C G C A A -3’

3’-T A C G C C G T A A C C T C T G A G A G A C T C G T G A C G C G T A G C G T T -5’.

 

В ходе ПЦР могут быть использованы следующие праймеры:

а. 5’-G C G G C A T T G G-3’,

б. 5’-G A C T C T C T G A-3’,

в. 5’-T T G C GA T G C G- 3’,

г. 5’-A G A C T C T C T G-3’.

Отжиг каких пар праймеров даст продукты амплификации? Какой длины будут ампликоны, если смешать все праймеры?

 

4. Если бы Кэри Мюллис в 1983 году (25 декабря) запустил амплификацию одного фрагмента ДНК из одной клетки эпителия кожи, то сколько бы копий ампликона наработалось к сегодняшнему дню? Скорость ПЦР – 1 цикл в день.

 

5. В ходе ПЦР было получено 7 фрагментов разной длины. ДНК было выделено из 7 клеток. Использовался только один тип праймера. Сколько раз отжегся праймер в первом цикле ПЦР?

Сколько раз отжегся праймер во втором цикле ПЦР?

 

6. В ходе ПЦР образуется 1 фрагмент ДНК. ДНК была выделена из одной клетки. Полимеразная цепная реакция была прервана во время стадии денатурации ДНК 9-го цикла. Насколько уменьшилось количество свободных молекул праймера?

 

8. Во время детекции продуктов амплификации можно видеть, что некоторые ампликоны имеют разную толщину. Почему?

 

9. Почему для проведения ПЦР нельзя использовать

ДНК-полимеразу человека, растительное масло, обычную воду?

 

10. В ходе ПЦР амплифицируется 1 ДНК-фрагмент. ПЦР была прервана на 35 цикле (III стадия). В ходе ПЦР используется праймер 5’-C A T C A T C A T -3’. Какой будет длина ДНК-фрагмента, если объединить все молекулы праймера, которые успели отжечься к этому моменту?

 

11. Сколько нужно молекул праймера, чтобы амплифицировался 1 фрагмент ДНК в течение 26 циклов?

 

12. В составе генома человека приблизительно 3,2 миллиарда пар нуклеотидов. В ходе ПЦР амплифицируется фрагмент ДНК длиной 512 п.н. Сколько понадобится циклов ПЦР, чтобы сумма двухцепочечных ампликонов по количеству п. н. стала в 7 раз больше, чем геном человека?

 

 

В.В. Оберемок

Методические рекомендации

К применению ПЦР-метода

 

для студентов 5 курса дневной формы обучения

специальности 8. 070402

«биология»

образовательно-квалификационного уровня «магистр»

профессионального направления подготовки

0704 «биология»

и

для студентов 3 курса дневной формы обучения

специальности 6.070300

«биохимия»

образовательно-квалификационного уровня «бакалавр»

профессионального направления подготовки

0703 «химия»

 

 

Симферополь 2008

 

Рекомендовано к печати научно-методическим

советом ТНУ от 02.11.2006

протокол № 2

 

 

СОДЕРЖАНИЕ

 

Теоретическая часть (лекции)

Лекция 1. Смысл полимеразной цепной реакции (ПЦР).......4

Лекция 2. Оборудование для ПЦР-метода..............................7

Лекция 3. Организация ПЦР-лаборатории и

правила поведения в ней….......................................................9

Лекция 4. Типичные ошибки при использовании

ПЦР-метода..............................................................................11

Лекция 5. Применение ПЦР-метода для разных видов

научно-исследовательской работы.........................................12

Лекция 6. Подбор праймеров………………………………..15

Лекция 7. «Золотая середина» концентраций веществ в

ПЦР-смеси…………………………………………...…...…..16

 

Практическая часть (лабораторные занятия)

Занятие 1. Выделение ДНК....................................................18

Занятие 2. Амплификация ДНК..............................................21

Занятие 3. Детекция продуктов

амплификации ДНК (электрофорез)......................................24

 

Задачи и вопросы.....................................................................27

Краткий словарь терминов и

дополнительные сведения.......................................................29

Список рекомендуемой и цитируемой литературы………..34

Список рекомендуемых веб-сайтов…………………….…. 34

 

Лекция 1. Смысл полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР – полимеразная цепная реакция, в ходе которой амплифицируются определенные участки ДНК. ПЦР была изобретена американским ученым Кэри Мюллисом в 1983 году. Широкие возможности, сравнительная дешевизна и простота ПЦР позволили использовать этот метод генетического анализа в разных областях научных исследований. В основе ПЦР лежит естественный для клеток процесс репликации (рис. 1). Отличие ПЦР от репликации состоит в том, что ПЦР происходит in vitro и воспроизводит репликацию частично.

1- геликаза

2- топоизомераза

3- ДНК-полимераза

4- ДНК-полимераза

5- лигаза

6- фрагмент Оказаки (затравка)

7- нуклеотидтрифосфаты

8- ДНК

 

Рис. 1. Репликация ДНК

 

Основные компоненты реакции:

dNTP (нуклеотидтрифосфаты), Taq-полимераза, праймеры, Mg²⁺, ПЦР-буфер, деионизованная вода, исследуемая ДНК. Полимеразная цепная реакция делится на циклы. Каждый цикл состоит из нескольких стадий: денатурация, отжиг праймеров, наращивание (комплементарное достраивание) цепи. Для каждой стадии характерны своя температура и временной интервал. Количество ампликонов разной длины, образующихся в конце ПЦР, теоретически можно рассчитать, если знать места отжига праймеров. Классическим примером является отжиг одного праймера по одному разу на каждой из цепей ДНК. Необходимо, чтобы при этом 3'-концы праймеров были впереди по отношению друг к другу (рис.1). Два двухцепочечных фрагмента (ампликона), которые появляются в конце 3 цикла в этом примере, дадут через n циклов следующее количество копий: F = 2∙2ⁿ, где F-количество двухцепочечных фрагментов ДНК, а n - количество циклов.

 

Рис. 2. Амплификация ДНК (окончание на следующей странице)

P – праймер, ffffffff – наращиваемая цепь

 

Рис. 2. Амплификация ДНК