Дифференциальная окраска хромосом.

В зависимости от целей цитогенетического исследования используются различные методы окрашивания хромосом (см. рис. 9). Наиболее распространенными из них являются рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q-, G, С-, R- и NOR- или Ag-окраска.В свою очередь, методы

дифференциального окрашивания делятся на две группы:

1) приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q-, G- или R-сегменты);

2) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С-, Т- или NOR-сегменты). Рис.9.Методы окрашивания хромосом (8)

Рутинная окраска хромосом достигается путем простого окрашивания полученных хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимза (азурэозином) или 2% ацетоорсеином, или 2% ацетокармином, без какой-либо их предварительной обработки. Такая окраска приводит к равномерному и интенсивному прокрашиванию хромосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные морфологически сходные хромосомы набора. Исторически рутинная окраска была самой первой используемой в цитогенетике человека окраской, активно применяющейся в течение 1959-1970 гг., до внедрения методов дифференциального окрашивания хромосом. В настоящее время она практически не применяется для диагностики конституциональных хромосомных нарушений, однако находит применение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факторов среды на мутагенную активность. Такую окраску можно применять для выявления численных аномалий хромосом.

Q-окраска (от англ. Quinacrine - акрихин) выявляется на хромосомах в виде чередования ярко- и темно-флюоресцирующих полос с помощью флуоресцентной микроскопии хромосомных препаратов, окрашенных такими флюорохромами (флуоресцентными красителями) как производные акридина - акрихин дигидрохлорид (атебрин) или акрихин-иприт. Эти красители обладают способностью присоединяться к ДНК путем интеркаляции или с помощью внешних ионных сил. Q-окраска имеет свою кодировку (QFQ)по международной цитогенетической номенклатуре. Заслуга применения производных акрихина для получения Q-сегментов на хромосомах человека принадлежит шведскому цитогенетику Касперссону (1970 г.). В популяциях человека существует межиндивидуальная вариабельность отдельных участков хромосом, выявляемых с помощью Q-окраски - Q-полиморфизм хромосом. Он выражается в особенно ярко светящихся сегментах, локализованных в центромерных участках (сеn) хромосом 3 и 4, а также в коротких плечах (p11) и спутниках (р13) всех акроцентрических хромосом человека 13-15, 21 и 22. Кроме того, у лиц мужского пола ярко флюоресцирующейся областью является и дистальная часть длинного плеча хромосомы Y - сегмент q12. Этот участок Y-хромосомы обладает выраженным межиндивидуальным полиморфизмом и четко наследуется по мужской линии. Все перечисленные ярко флюоресцирующие участки хромосом являются областями локализации некодирующих повторяющихся гетерохроматиновых последовательностей ДНК, вариабельность которых не приводит к каким-либо фенотипическим изменениям. Указанные выше ярко флюоресцирующие Q-полиморфные хромосомные сегменты являются удобными цитогенетическими маркерами и могут быть использованы как для характеристики популяций, индивидов и клеточных линий, так и для решения некоторых судебно-медицинских проблем. Метод позволяет даже в интерфазном ядре идентифицировать У-хромосому человека по яркой флуоресценции.

G-окраска (от англ. Giemsa - Гимза) выявляется благодаря предварительной обработке хромосомных препаратов слабым раствором протеолитического фермента трипсина и последующей окраске красителем Гимза. При этом наблюдается полосатая исчерченность хромосом, где темные полосы в некоторой степени соответствуют гетерохроматиновым районам, а светлые -эухроматиновым. G-окраска имеет свою кодировку (GTG) по международной цитогенетической номенклатуре. Оптимальные условия окраски находят в каждой лаборатории эмпирическим путем. Методика G-окраски хромосом человека была впервые предложена английской исследовательницей М. Сибрайт в 1972 году и практически в неизменном виде используется до настоящего времени. По числу, величине и расположению выявляющихся сегментов рисунок G-окраски аналогичен рисунку при Q-окраске, где темно окрашенные G-сегменты соответствуют флюоресцирующим Q-сегментам. Различия состоят в том, что: а) несветящиеся гетерохроматиновые центромерные сегменты в хромосомах 1 и 16 хорошо прокрашиваются красителем Гимза; б) ярко флюоресцирующие при Q-окраске сегменты 3, 4, 13-15, 21, 22 и Y-хромосом не выделяются особой интенсивностью при G-окраске. На G-окрашенных метафазных хромосомах выделяется около 320 сегментов на гаплоидный геном. Преимущество метода в том, что он не требует использования флуоресцентного микроскопа и окрашенные препараты можно длительно хранить.

R-окраска (от англ. Reverse - обратная) отличается противоположностью рисунка G-окраске. Темноокрашенными здесь являются эухроматиновые участки хромосом, а светлыми - гетерохроматиновые. Существует несколько модификаций метода R-окраски и каждый из них имеет свою кодировку по международной цитогенетической номенклатуре. Одним из них является обработка препаратов Ва(ОН)₂ с контролируемой тепловой денатурацией и последующей отмывкой в дистиллированной воде и окрашиванием раствором красителя Гимза. Кодировка R-окраски, полученной таким способом - RHG.

С-окраска (от англ. Constitutive heterochromatin - конститутивный гетерохроматин) выявляется в виде вариабельных по величине темноокрашенных сегментов конститутивного гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом, в то время как эухроматиновые участки хромосом прокрашиваются очень бледно. Методы получения С-окраски могут варьировать, но важным условием является предварительная обработка препаратов щелочью с последующей двухчасовой инкубацией препарата в двукратном стандартном солевом растворе при 65°С. Окраску препаратов производят красителем Гимза. С-окраска имеет свою кодировку (CBG) по международной цитогенетической номенклатуре. Конститутивный гетерохроматин построен преимущественно из многократно повторяющихся последовательностей ДНК, так называемой сателлитной ДНК, выявляемой во время градиентного центрифугирования хроматина. В популяциях человека, также как и в случае Q-окрашивания, существует межиндивидуальная вариабельность по определенным участкам хромосом, в данном случае по величине блоков С-гетерохроматина, выявляемых с помощью С-окраски (С-полиморфизм хромосом). По локализации выделяют четыре типа С-хроматина: 1) собственно центромерный, присущий всем хромосомам, с относительно небольшими по площади темноокрашенными блоками; 2) более крупные блоки гетерохроматина, располагающиеся в прицентромерных районах длинных плечей аутосом 1, 9 и 16, обладающие четко выраженным межиндивидуальным полиморфизмом; 3) большой блок гетерохроматина дистальной части длинного плеча Y-хромосомы, заметно варьирующий по величине у разных лиц мужского пола; 4) гетерохроматин коротких плеч акроцентрических хромосом. Метод выявления центромерного гетерохроматина позволяет прежде всего оценить хромосомный полиморфизм четырех хромосом набора -1, 9, 16 и Y, а также используется в практике клинической цитогенетики для уточнения характера структурных перестроек, затрагивающих данные хромосомы. По международной цитогенетической номенклатуре увеличенные или уменьшенные блоки гетерохроматина обозначаются как qh+ или qh- (h гетерохроматин). Например, запись кариотипа 46,XX,9qh+ означает, что у нормальной женщины имеется вариант хромосомы 9 с большим гетерохроматиновым блоком в длинном плече, а запись 46,XYqh- означает, что у мужчины имеется уменьшение длины гетерохроматинового блока на длинном плече Y-хромосомы.

NOR-окраска (от англ. Nucleolar Organizer Region - Ядрышко-Образующие Районы - ЯОР) или Ag-окраска (серебрение) применяется для выявления ядрышкообразующих районов, расположенных в коротких плечах (сегмент ql2 - спутничная нить) всех 5 пар акроцентрических хромосом человека (13, 14, 15, 21 и 22), с помощью окрашивания солями серебра. Известно, что районы ядрышковых организаторов содержат гены рибосомальной РНК (рРНК). Единица транскрипции генов рРНК содержит гены 5,8S, 18S и 28S РНК. Ряды рРНК транскрипционных единиц располагаются тандемно вдоль ДНК и отделяются друг от друга нетранскрибируемыми последовательностями - спейсерами. Транскрибируемый район и нетранскрибируемый спейсер тандемно повторяются примерно 40 раз в каждой из 5 пар акроцентрических хромосом, составляя около 400 копий рибосомных генов на геном. В настоящее время для визуализации этих районов на метафазных хромосомах применяют метод серебрения Хоуэлла и Блэка (1980 г.). С помощью этого метода сами хромосомы окрашиваются в желтый цвет, а в коротких плечах акроцентрических хромосом на спутничных нитях четко выделяются черные точечные образования - глыбки восстановленного металлического серебра. Размеры этих глыбок, отражающие активность ЯОР, которые функционировали в предшествующей интерфазе, на разных хромосомах существенно варьируют - от отсутствия заметной окраски - до достаточно крупных блоков серебра (Ag-полиморфизм). Тонкие механизмы окраски ядрышкообразующих районов хромосом пока неизвестны, но ясно, что красящим субстратом является не ДНК рибосомных генов и не рРНК, а кислые белки, связанные с ней. Для оценки данного типа хромосомного полиморфизма предложена полуколичественная 5-балльная система оценки активности ЯОР каждой из пяти пар акроцентрических хромосом генома человека (0 - отсутствие окраски, 1 - слабая, 2 - средняя, 3 - сильная и 4 - очень сильная окраска ЯОР хромосом, при которой размеры Ag-блока значительно превышают толщину хроматид). При сложении баллов отдельных ЯОР может быть оценена активность всех 10 ЯОР генома по критерию суммарной функциональной активности ЯОР, предложенному Н.А. Ляпуновой с соавт. (1988). В популяциях человека существует межиндивидуальный полиморфизм Ag-окрашенных хромосом, который выражается в специфичности степени окраски отдельных хромосом у разных индивидов, являющейся наследуемой характеристикой.

Т-окраска (от англ. Telomere - теломера) - применяется для выявления теломерных районов хромосом в коротких и длинных плечах. Метод включает инкубацию препаратов хромосом при 87°С в течение 20-60 мин в растворе фосфатного буфера при рН 5,1 с последующей окраской раствором красителя Гимза.