Роллерное культивирование клеток

№25

Величина дозы задается пользователем в определенном диапазоне (2−20 мкл, 20−200 мкл, 200−1000 мкл). Комплект дозаторов пипеточных КДП-1 включает 8 моделей, каждая из которых обеспечива- ет выдачу 2 фиксированных по объему доз (от 5 до 1000 мкл). Комплект дозаторов П1 включает 5 моделей, настроенных на 1 фиксированную до- зу (от 20 до 500 мкл). Все указанные типы устройств предполагают ис- пользование сменных наконечников, которые могут подвергаться паро- вой стерилизации и повторно использоваться. Описанные выше приборы позволяют работу с жидкостями, нагре- тыми до 40° С и имеющими вязкость, близкую к вязкости воды. Тем самым не обеспечивается дозирование питательных сред на основе агара, которые для придания им малой вязкости должны быть нагреты до темп-ры не менее 60о С. В таких случ-х исп-ся приборы типа «Агар-1». Этот аппарат для разлива питательных сред, состоящий из перистальтического насоса-дозатора и разливочного механизма, обеспеч-ет автомат-ое одновременное заполнение в течение 1 мин 16 стеклянных ч. Петри д. 100 мм, наход-хся в спец-х планшетах. Стерильные условия в аппарате поддерживаются путем УФ облучения его внутреннего объема. В экспериментах также приме-ся устр-ва малой лаб-ной техники, не являющиеся по своей сути дозаторами, но спос-ные облегчить этот процесс. Это так назыв. приб. «Pipet-Aid»  предназначенные для пробо- отбора и выдачи дозы при работе с пип-ми Пастера и любыми градуированными пип-ми емк-ю до 75 мл. Пипетка вставляется в спец. держатель, соед-ный с малогабаритным вакуумным насосом, находящимся либо непосредственно в держателе, либо автономно. Управление работой прибора произв-ся нажатием кнопок.

№26

Одним из главных требований к жидким питательным средам для клеточных культур является их стерильность, достигаемая в ряде случаев и так называемой стерилизующей фильтрацией, освобождающей пита- тельные среды от примесных частиц, бактерий и коллоидов.

 Следует различать микро- и ультрафильтрацию сред. При микрофильтрации из жидкости удаляются частицы примесей и бактерий размерами от 0,25 до 10 мкм. Ультрафильтрация приводит к извлечению из раствора очень мелких частиц и коллоидов, а также молекул растворенных веществ с молекулярными массами от 1 тыс. до 1 млн.

Процесс микрофильтрации осуществляется пропусканием жидкости через мембранные или глубинные фильтры. Ряд недостатков, свойственных глубинным фильтрам, изготавливаемым из ваты, стекловолокна, асбеста, фарфора и других материалов (например, возможность роста микроорганизмов в массе фильтра, поглощение значительных количеств фильтруемых жидкостей), делают предпочтительным использование при очистке питательных сред мембранных фильтров, которые имеют поры гарантированного размера и лишены перечисленных выше недостатков.

Мембранные фильтры изготавливаются из различных полимеров, в том числе позволяющих стерилизацию (фторопласт, поливинилдендифторид, эфиры целлюлозы) и обеспечивающих химическую стойкость к компонентам питательных сред.

 Для стерилизующей фильтрации питательных сред чаще всего используются мембранные фильтры диаметром 0,2−0,22 мкм.

 Для очистки питательных сред пригодны мембранные69 фильтры, производимые фирмами «Millipore», «Sartorius», «ShleiherShull», и другие.

 В общем случае установка для стерилизующей фильтрации состоит из системы создания избыточного давления на фильтруемую жидкость, стерильного держателя фильтра, фильтрующей мембраны, трубопроводов и сосудов для размещения фильтруемой жидкости и фильтрата.

Для обеспечения движения жидкости через фильтр к ней необходимо приложить определенное давление извне. Подобное давление может быть создано центробежными силами, вакуумом на выходе установки, но чаще для этой цели используется подача нейтрального газа (например, азота) под определенным давлением в сосуд со средой, подлежащей очистке. Величина избыточного давления зависит от размера пор и пло- щади мембраны.

 

 

№27

При выд-нии микроорганизмов и сохранении чистых культур необходимо, чтобы среда не содержала никаких посторонних микробов, что достигается обеспложиванием или стерилизацией.

Стерилизуют как среды, так и материалы, инструменты, аппараты, которыми пользуются при работе. Стерилизация бывает:

 - физическая - химическая - биологическая

Физическая стерилизация подразделяется на термическую и холодную.

 Термическая стерилизация- стерилизация под действием высоких температур, вызывающих денатурацию клеточных белков, разрушающих осмотический барьер клеток, нарушающих равновесие ферментативных реакций, что приводит к гибели клетки.

Термическая стерилизация осуществляется различными способами:  1. Прокаливание в пламене горелки. Так стерилизуют бактериальные петли, иглы, кончики пинцетов, горлышки колб и пробирок, ватные пробки (кратковременно). 2. Кипячение. Производят в стерилизаторе. Стерилизуют шприцы, ножницы, скальпели, пинцеты, резиновые перчатки и резиновые пробки. 3. Стерилизация сухим жаром. Осуществляется в сушильных шкафах при температуре 160 0 С – 2 ч., 165 0 С – 1 ч., 180 0 С – 40 мин. Горячим воздухом чаще всего стерилизуют стеклянную посуду. 4. Стерилизация влажным жаром (текучим паром). Производится в аппарате Коха или в автоклаве при открытом выпускном кране. Т. О. стерилизуют питательные среды, свойства которых изменяются при температурах выше 100 0 С.

Обработку материала текучим паром используют для проведения дробной стерилизации (тиндализации) – трехкратной обработки питательной среды влажным жаром в течение одного часа при температуре 70 – 80 0 С с интервалами 24 ч., во время которых поддерживается температура, благоприятная для прорастания спор. Проросшие из спор вегетативные клетки быстро погибают при очередном нагревании. 5. Стерилизация влажным жаром под давлением (автоклавирование). Наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации питательных сред. Основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Время стерилизации 10 –45 мин. Температура пара возрастает при повышении его давления.

6. Неполная стерилизация (пастеризация). Достигается выдерживанием материала при 60 0 С в течение 30 мин, при 75 0 С –15 мин, при 90 0 С без выдержки. Широко применяется для частичной стерилизации легко портящихся пищевых продуктов (молоко, соки, сиропы). В почвенной микробиологии пастеризуют суспензии почв, чтобы освободить их от вегетативных клеток, но сохранить споры бактерий.

Холоднаястер. Вкл-т :

-1. Фильтрацию, которая закл-ся в пропускании жидкостей ч\з спец. фильтры, имеющие мелкопористые перегородки и поэтому задерживающие клетки микр-змов.

 Используют следующие типы фильтров:

• Мембранные фильтры

• Фильтры Зейтца (диски из смеси асбеста с целлюлозой)..

• Мелкопористые стеклянные фильтры

• Фарфоровые фильтры в виде полых свечей из каолина с примесью кварцевого песка (свечи Шамберлана)

№27

-2. Стерилизацию облучением, основанную на летальном эффекте, которое оказывают уф-, рентгеновские, γ -, α -, β - лучи и нейтроны. В лаб-х усл-х обычно исп-т уф лучи, источником которых являются специальные бактерицидные лампы,их используют для частичной стерилизации открытых поверхностей и воздуха. Применение ультрафиолета ограничено из-за его малой проникающей способности. Вегетативные формы бактерий более чувствительны к УФ- облучению, чем споры.

-3 Стерилизацию ультразвуком, создаваемым в жидкостях при помощи вибрирующих никелевых или кварцевых дисков. Разрушение клеток при ультразвуковом воздействии обусловлено возникновением вторичных явлений – кавитации. В результате действия звуковой волны высокой частоты образуются разрывы в жидкости, которые затем образуют пузырьки. При их захлопывании идет сильная гидравлическая волна, достигающая 10 атм., что приводит к механическому разрушению клеток. К ультразвуку чувствительны все микроорганизмы, в том числе и споровые. Но по степени чувствительности они значительно отличаются.

Химическая стерилизация представляет собой удаление или разрушение микроорганизмов, находящихся на неживых объектах или поверхностях, с помощью химических агентов, получивших название дезинфицирующих веществ. В качестве дезинфицирующих агентов применяют галогены и их производные (гипохлорид натрия, хлорамины, спиртовой раствор йода), фенольные соединения, спирты, микробоцидные газы (формальдегид, окись этилена). Для консервации питательных сред, вакцин и сывороток используют хлороформ, толуол, эфир, формалин и др.

Биологическая стерилизация основана на применении антибиотиков.

№28

Стерилизация питательных сред, как и все другие манипуляции при работе с клет-ми культурами, провод-ся в боксовых помещениях или в ламинар-боксах.

Боксовое помещение представляет собой изолированную комнату с несорбирующими пыль моющимися покрытиями, имеющую предбоксник и обеспеченную необходимым общим и специальным освещением, системами приточной и вытяжной вентиляции, холодным и горячим водоснабжением, а также подводами газов и сжатого воздуха. Альтернативой боксовым помещениям, требующей меньших затрат на оборудование, являются ламинар-боксы, или стерильные рабочие места.

  В этом случае в любом помещении может быть создан локальный стерильный объем, необходимый для работы и создающий биологическую защиту пользователей. Технически задача решается путем постоянного обдува места проведения работ ламинарным потоком. При работе с заведомо непатогенными материалами поток обеспыленного воздуха из рабочей зоны выходит непосредственно в окружающее пространство. В случае работы с потенциально патогенным материалом воздух перед выходом из рабочей зоны дополнительно фильтруется, возможность обдува оператора при этом исключена.

   В зависимости от устройства ламинар- бокса поток обеспыленного воздуха в рабочей зоне может быть горизонтальным, вертикальным или наклонным. Ламинар-бокс с горизонтальным потоком обеспыленного воздуха типа УОБГ (установка обеспылевания биологическая с горизонтальным потоком) обеспечивает очистку воздуха, подаваемого в рабочую зону, путем фильтрации на фильтрах грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор (по мере загрязнения грубый фильтр промывается, тонкий сменя- ется). Прибор имеет встроенные источники освещения, УФ облучения (для стерилизации рабочей зоны в перерывах между использованием бокса) и регулятор скорости воздушного потока. Организация ламинар-боксов с вертикальным и наклонным потоками обеспыленного воздуха типов УОБВ и УОБН аналогична организации ламинар-бокса с горизонтальным потоком, описанным выше. Ламинар-бокс для работ с потенциально патогенными культурами типа БП-4004 («Бокс-Р») имеет некоторые отличия. В приборе обеспечи- вается рециркуляция воздушного потока, заключающаяся в том, что воз- дух из рабочего объема попадает на специальный фильтр тонкой очист- ки, откуда часть его выходит в окружающее пространство, а остальной поток повторно проходит через фильтр тонкой очистки и вновь поступа- ет в рабочий объем. Этим достигается невозможность выноса обрабатываемого материала в помещение. Возможность попадания выходящего воздуха на оператора предотвращается созданием зоны подсоса на открытой стороне рабочего объема бокса. Прибор имеет встроенные источники света и УФ облучения, столешницу из нержавеющей стали. Пе- редняя часть рабочего объема закрыта прозрачным стеклом, перемещаемым по высоте. Бокс снабжен системой регулирования скорости потока воздуха и индикаторами загрязнения фильтра тонкой очистки. Перечисленные выше типы ламинар-боксов предназначены для размещения в любых производственных помещениях, имеющих приточную вентиляцию с грубой предварительной очисткой воздуха.

№29

Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны отвечать ряду специальных требований:

 1) обеспечивать высокую стабильность поддержания заданной температуры;

2) создавать минимальный градиент температуры по полезному объему;

3) обладать системой быстрого восстановления температуры после кратковременного открывания полезного объема;

4) внутренний объем должен изготавливаться из био- логически пассивных материалов, т. е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред.

 Материалы и покрытия внутренних и наружных частей конструкции термостата должны позволять деконтаминацию водными растворами спирта ректификата и стерилизацию УФ облучением.

 По своей конструкции лабораторные термостаты подразделяются на жидкостные и воздушные.

 В жидкостных термостатах полезный объем окружен емкостью, наполненной дистиллированной водой, которую собственно и нагревают.

Воздушные термостаты имеют полезный объем, непосредственно контактирующий с электронагревательными элементами.

 Жидкостные термостаты обеспечивают малые значения температурного градиента в камере, но имеют очень большую тепловую инерцию и поэтому длительное время вхождения в рабочий режим.

Усовершенствованные формы воздушных термостатов, ранее уступавших жидкостным по ряду основных параметров, теперь составляют значительную часть серийно выпускаемых моделей.

№30

СО2-инкубаторы Необходимость поддержания постоянной величины рН в питательной среде и ее минимального испарения в период инкубации клеток при- вела к разработке специальных приборов, аналогичных описанным выше термостатам.

 Главным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в полезном объеме и высокой относительной влажности в нем.

 Это так называемые углекислотные инкубаторы, выпускаемые фирмами «Heraues», «Hotpack», «Flow». Газовая среда в камерах СО2-инкубатора содержит повышенную кон- центрацию кислорода и углекислого газа, а в большинстве случаев только углекислого газа. Величина концентрации задается по условиям куль- тивирования и поддерживается автоматически. В автоматических СО2- инкубаторах заданный состав газовой среды поддерживается дозированным поступлением нужного газа в поток очищенного от пыли внешнего воздуха, подаваемого во внутренний объем прибора.

Другой разновидностью инкубаторов являются так называемые газопроточные инкубаторы типа ГПИ-1, где подача нужных газов производится непрерывно, а точ- ное процентное содержание достигается изменением скорости протока.

№31 Лабораторные встряхиватели Большое значение в оснащении лаборатории, предназначенной для культивирования клеток, имеют приборы, обеспечивающие принудительное перемешивание питательных сред с помещенными в них клеточными культурами, обеспечивая лучший газообмен и тем самым повышая эффективность культивирования. Большинство моделей встряхивателей позволяет перемешивание в одном режиме – вращательном или возвратно-поступательном. Хотя наиболее современные модели (фирма «Infors») являются универсальными, т. е. работают в разных режимах перемешивания. Роллерные установки – аппараты, позволяющие успешно применять один из общепринятых методов культивирования клеток – выращивание их в цилиндрических сосудах из боросиликатного стекла с небольшим количеством питательной среды, вращающихся в горизонтальном положении со скоростью 8 оборотов/мин, обеспечивая постоянное перемешивание питательной среды и интенсивный рост клеток.

Для повышения эффективности массового культивирования установки обеспечены системой, дающей возможность заменять питательную среду и удалять супернатант без остановки вращения. Для этого сосуды снабжаются специальными перфузионными пробками, в которых центральная часть вращается независимо от периферийной. В эту часть пробки вво- дятся трубки для смены питательной среды, удаления супернатанта и введения инокулята. В состав данной системы также входят перистальтические насосы и блок автоматики, регулирующий их работу.

№32

Лабораторные ферментеры Это комплексы приборов и аппаратов для массового суспензионного или глубинного культивирования клеточных и бактериальных культур. В лабораторной практике ферментеры применяются для ведения научно- исследовательских работ или отработки технологии массового культивирования (пилотные биореакторы).

В общем случае ферментер состоит из культивационного сосуда, насосов и соединительных трубопроводов (для подачи питательной среды, газов, инокулята и отбора продукта), измерительных приборов и регуляторов, управляющих температурой среды в сосуде, ее рН, окислительно- восстановительным потенциалом и другими параметрами.

В лаб. практике наиболее часто применяются ферментеры с емкостью сосудов от 1 до 20 л, для отработки технологий – от 30 до 400 л.

 Во всех случаях питательной средой заполняется не более 75 % объема сосуда. Части ферментеров, контактирующие с питательной средой (сосуды, соединительные трубопроводы, насосы и др.), изготавливаются из био- логически пассивных, химически стойких материалов, позволяющих производить стерилизацию насыщенным водяным паром (качественная нержавеющая сталь, фторопласт, боросиликатное стекло, силиконовая резина).

 Сосуды ферментеров имеют цилиндрическую (реже коническую) форму.

№32

В них размещены датчики температуры, рН, кислорода, а также система для аэрации питательной среды, производимой барботированием газов (подача газов снизу через барботер) через питательную среду или сочетанием продувки газов с механическим перемешиванием среды.

При использовании механических мешалок их соединение с приводным двигателем производится при помощи магнитных муфт, что снижает риск загрязнения питательной среды.

Помимо механического и пневматического перемешивания используются также системы циркуляционного (гидродинамического) перемешивания направленным током жидкости по замкнутому контуру при помощи насосов.

 Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время роста образуют довольно много пены.Образование на поверхности среды культивирования слоя из пузырьков связано с наличием в среде поверхностно-активных веществ (ПАВ), к числу которых относятся продукты распада жиров – мыла, а также белки. ПАВ включают как полярные ионные, так и неполярные группировки. Заряженные группы имеют сродство к водной фазе, а нейтральные выталкиваются в воздушную фазу, где, встраиваясь в стенки газовых пузырьков, увеличивают время их жизни.

Умеренное пенообразование способствует росту многих аэробных микроорганизмов (пенный слой – кислородный коктейль). Особое внимание уделяется борьбе с избыточным пенообразованием, так как если не пре- пятствовать этому, пена смачивает фильтры для стерилизации воздуха, что приводит к контаминации культуры посторонней микрофлорой, уменьшению полезного объема биореактора, а также выходу пены нару- жу. Контроль пенообразования осуществляется путем введения в сосуд специального датчика. Для борьбы с избыточным пенообразованием ис- пользуется механическое и химическое пеногашение. При механическом пеногашении лопасти пеногасителя размещаются на валу мешалки.

 При химическом пеногашении в крышке сосуда предусматривается специальный ввод для реагента гашения. Химические пеногасители более дешевы, их используют время от времени при необходимости подавления пенообразования.

Однако при добавлении этих веществ может изменяться состав питательной среды. Пеногасящие вещества растительного (кукурузное, касторовое, соевое, подсолнечное масло, масло из семян хлопчатника и другие) и животного (свиной, говяжий, бараний, китовый и другие жиры) происхождения могут служить микроорганизмам источником углерода и энергии и, следовательно, стимулировать их активное развитие. Однако известны случаи, когда природные пеногасители оказывали отрицательное действие на метаболизм клетки. А такие неметаболизируемые пеногасители, как силиконы, в высокой концентрации токсичны. Поэтому пеногасители, являющиеся поверхностно-активными веществами, следует использовать только в очень низких концентрациях и только после тщательной проверки. Пеногасители добавляют непосредственно в среду перед стерилизацией или в ферментер через специ- альный ввод.

№33

Биореакторы с механическим перемешиванием характеризуются тем, что воздух подают под давлением через распределитель, представляющий собой кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом образуются мелкие пузырьки воздуха и за счет механического перемешивания, обеспечивается их равномерное распределение внутри аппарата. Для этой же цели используются мешалки, которые, разбивая крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору. Эффективность распределения воздуха зависит от типа мешалки, числа ее оборотов и физико-химических свойств используемой среды. При интенсивном перемешивании часто случается вспенивание, поэтому рабочий объём биореакторов такого типа не превышает 55 %.

Биореакторы с барботажной системой воздухораспределения характеризуются тем, что перемешивание в них осуществляется восходящими потоками воздуха, который подают под высоким давлением в нижнюю часть биореактора через барботеры, представляющие собой воздушные трубы с отверстиями диаметром 0,1-0,2 мм. Подача воздуха под сильным давлением приводит к сильному пенообразованию, поэтому рабочий объем биореакторов такого типа также не превышает 55 %.

Биореакторы с эрлифтной системой воздухораспределения характеризуются тем, что воздух подают через центральную трубу, которая обеспечивает внутреннюю циркуляцию жидкости, либо за счет внешней системы циркуляции, которая осуществляется также с помощью труб, установленных снаружи аппарата.

№34

Конструктивные различия ферментеров определяются в основном способами подвода энергии и аэрации среды.

 По этому принципу ферментеры дел-ся на три гр.:

- ферментеры с подводом энергии к газовой фазе;

- ферментеры с подводом энергии к жидкой фазе;

- ферментеры с комбинированным подводом энергии.

Ферментеры с подводом энергии к газовой фазе. В аппаратах этого типа аэрация и перемешивание культуральной жидкости осуществляются сжатым воздухом, который подается в ферментер под определенным давлением. Следовательно, на работу компрессора для сжатия воздуха затрачивается энергия.

Конструктивно эти ферментеры различаются способом подачи воздуха и конструкцией аэраторов (барботеров). Независимо от типа общая площадь отверстий в барботере должна быть не менее площади поперечного сечения трубопровода, по которому подводится воздух.

Барботажные ферментаторы по конструкции довольно просты. Они представляют собой металлические емкости цилиндрической формы. На дне аппарата расположены лучевые барботеры, через которые подается сжатый воздух.

Ферментеры с подводом энергии к жидкой фазе. Аппара­ты этого типа давно применяются в производстве кормовых дрожжей на гидролизатах растительного сырья на установках небольшой производительности. Усовершенствование конструкции самовсасывающей турбины позволило создать аппараты для крупнотоннажного производства кормовых дрожжей на парафинах нефти.

Ферментеры с комбинированным подводом энергии. В этих аппаратах осуществлен комбинированный подвод энергии к газовой фазе - для аэрации и к жидкой фазе для перемешивания. Ферментеры этого типа широко распространены в производстве антибиотиков, микроорганизмы-продуценты которых образуют колонии крупных размеров и, кроме того, растут на средах, отличающихся высокой вязкостью.

Ферментатор представляет собой цилиндрический сосуд со сферическим днищем, снабженный механической мешалкой и барботером .Барботеры устанавливаются, как правило, под нижним ярусом мешалки и могут быть различной конструкции.

 

 

№35

Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время роста образуют довольно много пены.    

Образование на поверхности среды культивирования слоя из пузырьков связано с наличием в среде поверх- ностно-активных веществ (ПАВ), к числу которых относятся продукты распада жиров – мыла, а также белки.

ПАВ включают как полярные ионные, так и неполярные группировки. Заряженные группы имеют сродство к водной фазе, а нейтральные выталкиваются в воздушную фазу, где, встраиваясь в стенки газовых пузырьков, увеличивают время их жизни.

 Умеренное пенообразование способствует росту многих аэробных микроорганизмов (пенный слой – кислородный коктейль).

Особое внимание уделяется борьбе с избыточным пенообразованием, так как если не препятствовать этому, пена смачивает фильтры для стерилизации воздуха, что приводит к контаминации культуры посторонней микрофлорой, уменьшению полезного объема биореактора, а также выходу пены наружу.

Контроль пенообразования осуществляется путем введения в сосуд специального датчика.

Для борьбы с избыточным пенообразованием ис- пользуется механическое и химическое пеногашение.

 При механическомпеногашении лопасти пеногасителя размещаются на валу мешалки.

При химическом пеногашении в крышке сосуда предусматривается специальный ввод для реагента гашения. Химические пеногасители более дешевы, их используют время от времени при необходимости подавления пенообразования.

Однако при добавлении этих веществ может изменять- ся состав питательной среды. Пеногасящие вещества растительного (кукурузное, касторовое, соевое, подсолнечное масло, масло из семян хлопчатника и другие) и животного (свиной, говяжий, бараний, китовый и другие жиры) происхождения могут служить микроорганизмам источником углерода и энергии и, следовательно, стимулировать их активное развитие. Однако известны случаи, когда природные пеногасители оказывали отрицательное действие на метаболизм клетки.

А такие неметаболизируемые пеногасители, как силиконы, в высокой концентрации токсичны.

 Поэтому пеногасители, являющиеся поверхностно-активными веществами, следует использовать только в очень низких концентрациях и только после тщательной проверки. Пеногасители добавляют непосредственно в среду перед стерилизацией или в ферментер через специ- альный ввод.

 

 

№36

Основная часть ассортимента спец. культуральной посуды предназначена для роста клеток в монослое, что определяет особые требования к свойствам поверхности и материала изделий как из стекла, так и из пластика.

 Для культивирования клеток обычно исп-ют флаконы, колбы, матрасы, чашки Петри, платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки и т. д.

Посуда из стекла Преимущества:хорошие адгезионные свойства поверхности, способствующие прикреплению клеток; многократность использования; биологическая инертность стекла ряда составов; термостойкость и другие. Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой, т. к. в пластике кислород может растворяться. Помимо этого из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения. Для стеклянной лабораторной и культуральной посуды на практике в основном применяются два типа составов – многощелочное и малощелочное боросиликатное стекло типа «Пирекс». Щелочесодержащие силикатные стекла имеют недостаточную термостойкость и химическую устойчивость к воде, кислотам и щелочам. Алюмоборосиликатные малощелочные стекла типа «Пирекс» характеризуются высокой устойчивостью к воде, устойчивостью к щелочным растворам и ко всем к-там, за исключением плавиковой (фтористоводородной) и горячей фосфорной. Кроме того, стекла типа «Пирекс» обладают хорошими оптическими свойствами.

Сущ. также группа макропористых стекол, которые не используются для изготовления посуды, но применяются при культивировании клеток в качестве микроносителей. Однако успех в эксперименте обеспечивается не только качеством стекла, но и степенью подготовки лабораторной посуды.

 Посуда для культивирования должна быть чистой физически, химически и бактериологически.

 Пластиковая посуда Начиная с 1965 г. все большее применение в лабораторной практике находит пластиковая посуда одноразового использования. При работе с культурами клеток пластиковая посуда в отдельных случаях более пригодна из-за характерных особенностей некоторых клеточных линий. Такая посуда проста в использовании, т. к. выпускается в стерильном, готовом к работе виде. Стерилизация производится в процессе изготовления физическими (облучение УФ светом или гамма-лучами) или химическими (газы – окись этилена, жидкости – этиловый спирт, раствор пергидро- ля) способами. Пластиковая посуда производится в двух модификациях:для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток.

Такое разделение вызвано тем, что культивируемые клетки (речь идет о монослойном культивировании) в отличие от бактериальных клеток находятся в непосредственном контакте с поверхностью сосуда, которая является для них субстратом. Клетки оседают на этой поверхности, прикрепляются и распластываются. Для улучшения адгезионных свойств поверхности из полистирола ее подвергают специальной обработке, в то время как биологическая посуда не обрабатывается. Таким образом, одним из первых условий успешного культивирования клеток является хороший субстрат, т. е. посуда, обеспечивающая максимальную адгезию, распластывание и, следовательно, рост.

№37

Исследование культивирования микроорганизмов начинается с 1830 г., когда Ш. Каньяр де Латур, К. Кютцинг и Т. Шванн открыли причину брожения вина (наличие клеток дрожжей).

В дальнейшем в области культивирования клеток не было никакого прогресса вплоть до 1850-х гг., когда Л. Пастер начал свои фундаментальные исследования: изучение физиологии дрожжей и бактерий, введение асептических методов, минимальных сред и исследование пищевых потребностей микроорганизмов и роли кислорода в процессах их жизнедеятельности.

 Работами Л. Пастера и его ученика М. Ролэна была установлена потребность в главных и второстепенных компонентах среды и в источниках энергии.

  Первая полная среда определенного состава была получена М. Ролэном в 1869 г. для культивирования грибов рода Aspergillus.

 Работа вызывает интерес еще и тем, что Ролэн определил пищевые потребности грибов не только качественно, но и количественно.

  Говоря о замечательных работах Л. Пастера и М. Ролэна, необходимо отметить, что в их распоряжении не было метода чистых культур, предложенного Р. Кохом несколько позже (в 1870-е гг.) и дающего значительные преимущества выращивания микроорганизмов.

  Начиная с изящных работ Коха, методы культивирования стали основной заботой микробиологов.

Потребность микроорганизмов в сложных органических веществах − факторах роста − впервые была обнаружена Вильдье в 1901 г., когда он от- крыл витамин В, или «факторы биос», необходимые для роста дрожжей.

 В 1930-е гг. с введением метода колб на качалках началось развитие аппаратуры культивирования.

Это дало возможность применять лабораторный метод для аэрации глубинных культур, особенно глубинных культур аэробных грибов, которые раньше выращивались только на поверхности твердых или жидких сред.

  В поверхностных культурах окружение организма гетерогенно, а в глубинных – гомогенно, что проще для изучения и контроля.

 Впоследствии глубинные культуры аэробных грибов сыграли значительную роль в развитии промышленного производства антибиотиков.

 Возрастающее технологическое значение культуры микроорганизмов значительно стимулировало интерес к этой области и привело в 40−50-е гг. к созданию ферментеров с автоматической регуляцией условий среды. С этого времени благодаря активному развитию теории непрерывного культивирования хемостатного типа открылись широкие горизонты не только теоретического развития, но и практического применения культур клеток.

№37

Идея возможности культивирования клеток вне организма была высказана еще в конце XIX в. Период с 1892 по 1902 г. можно считать предысторией развития метода культуры клеток и тканей растений.

 В это время немецкие ученые Х. Фехтинг, К. Рехингер, Г. Габерландт предпринимали попытки выращивать изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув экспериментальных успе- хов, эти первые исследователи, однако, высказали ряд идей, реализованных позднее.

В последующие 20 лет были получены первые результаты по культивированию тканей животных на питательных средах с добавлением сывороток.

 Но в растительном мире каких-либо значительных успехов достигнуть не удалось, несмотря на попытки создания оптимальных питательных сред, способных обеспечивать длительное существование и размножение клеток растений in vitro.

В 1922 г. В. Роббинс и Котте независимо друг от друга показали возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений. В 30−60-е гг. ХХ в., благодаря работе большого числа ученых (Ф. Уайт, Р. Готре и другие) число видов растений, клетки и ткани которых выращивали in vitro, достигло значительного количества (более 150).

Были описаны составы питательных сред, определены потребности культур в витаминах и стимуляторах роста, разработаны методы получения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а также культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки.

Ф. Стюард, работая с культурой изолированной флоэмы моркови, получил из нее в 1958 г. целые растения. Значительный вклад в развитие культуры клеток и тканей растений внесли исследования Р. Г. Бутенко и ее сотрудников, использовавших эти методы для изучения физиологии растительных клеток и морфогенеза растений

 В последующие годы были предложены методы получения изолированных протопластов из растительных тканей, найдены условия культивирования, при которых они способны образовывать новую клеточную стенку, делиться и давать начало клеточным линиям.

 С исп-ем изолированных протопластов были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью ПЭГ (полиэтиленгликоля) и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. С помощью метода культуры меристем были получены безвирусные экономически важные растения с высоким коэффициентом размножения.

В настоящее время активно продолжается разработка методов глубинного культивирования клеток, методов электрослияния изолированных протопластов и т. д. Использование методов получения сомаклональных вариантов, экспериментальных гаплоидов, скрининга биохимических мутантов привело к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных, лекарственных, декоративных и других растений.

 

 

№38

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная.

Значительно реже культивируют клетки опухолей растений различного происхождения. Культуры опухолевых клеток независимо от способа культивирования на уровне морфологии мало отличаются от культур каллусных клеток.

Значительным физиологическим отличием между ними является гормононезависимость опухолевых клеток, позволяющая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов.

Однако опухолевые клетки лишены способности давать начало нормально организованным структурам

 В некоторых случаях они способны образовывать тератомы (уродливые органоподобные структуры), нормальное развитие которых не происходит.

  Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести гормононезависимость.

Природа такой независимости к ауксину и цитокинину, чаще всего применяемым при выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормононезависимость клетки).

 При генетической гормононезависимости каллусные клетки ведут себя как опухолевые, при эпигенетической они теряют признак в ряду превращений клетка − растение − клетка.

 Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань, или каллус, представляет один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению. Для растения каллус является тканью, возникающей при исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей непродолжительное время.

 Эта ткань защищает травмированное место, накапливает питательные вещества для анатомической регенерации или генерации утраченного органа.

№39

Для получения культивируемых каллусных клеток in vitro фрагменты тканей разных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду в пробирки, колбы, чашки Петри.

Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий.

Для этого с помощью стерильных растворов, содержащих хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диа- цид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экспланты, тщательно отмывая их затем от используемого раствора стерильной водой. Питательные среды, растворы, инструменты, материалы, необходимые для работы, стерилизуют в автоклавах или сухожаровых шкафах.

 Все манипуляции с культурами проводят в микро- биологических боксах, облучаемых перед работой ультрафиолетом, или ламинарбоксах, где стерильность достигается постоянной подачей стерильного воздуха в рабочий объем.

Особенности дедифференцировки клеток экспланта и каллусогенеза зависят от эпигенетических характеристик составляющих его тканей.

 Клетки специализированных тканей, эксплантированных на питательную среду, содержащую минеральные соли, источники углерода, витамины и гормоноподобные вещества, должны дедифференцироваться, т. е. потерять структуры, характерные для их специфической функции в растении, и вернуться к состоянию делящейся клетки.

Часто эксплант, использу мый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы.

Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани, так как некоторые функци нальные особенности исходных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации или эпигенетически наследуемые признаки.

 В клетках экспланта, состоящего из неделящихся специализированных клеток, в самом начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматическими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к процессу деления. Для разделения этих процессов можно применять прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в течение нескольких суток (3−6).

 

 

№39

Это позволяет исключить не толькоизменения, связанные с травмой, но и возможное неконтролируемое влияние эндогенных гормонов эксплантата на изучаемые процессы.

 В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех типов РНК, исчезают тканеспецифические белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и каллусной ткани.

Это свидетельствует об изменении активности генов и белкового аппарата клеток при дедифференцировке. Образование каллуса не во всех случаях связано с травматическим воздействием.

Каллус может возникнуть в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Образование каллуса при эксплантировании фрагмента ткани в условиях in vitro свойственно двудольным и однодольным покрытосеменным и голосеменным растениям, папоротникам, мхам, печеночникам.

Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4−6 недель (в зависимости от скорости роста клеток), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Размер транспланта (переносимого кусочка) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно составляет от 60 до 100 мг массы ткани на 30−40 мл питательной среды.

Таким образом, техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интактного растения. Клетки различно дифферен- цированные (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу дедифференциации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус.

В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями. При культивировании растительных клеток и при выращивании культуры тканей применяются среды Мурасиге − Скуга, Нагата − Такебе, Хеллера, Нича−Нича, Кнудсона и другие в различных модификациях.

Основными компонентами питательных сред для культуры клеток и тканей растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, экстракты из разных органов растений).

№40

Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом на полужидкой агаризованной среде (концентрация агара – 0,6−1 %), среде с применением других желирующих полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги или дисках из пенополиуретана, погруженных в жидкую питательную среду.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым или красным; пигментированным полностью или зонально.

  В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают:

 1) рыхлыми, сильно обводненными, легко распадающи- мися на отдельные клетки;

2) средней плотности, с хорошо выраженны- ми меристематическими очагами;

3) плотными, с зонами редуцированно- го камбия и сосудов.

Как правило, в длительной пересадочной культуре, на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина − 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми.

В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растений онтогенез: они приступают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки и, наконец, деградируют.

Каллусные клетки, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, для регенерации растений, из них также получают суспензии клеток, культивируемых в жидкой питательной среде.

 

№41

Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными культурами. Получено еще сравнительно мало культур клеток высших растений, по своим параметрам полностью удовлетворяющих требованиям суспензионного (глубинного) культивирования.

В значительной мере это объясняется трудностями получения культуры клеток, состоящей преимущественно из отдельных клеток или небольших их агрегатов.

  Представляется целесообразным поэтому сначала рассмотреть методы получения клеточной суспензии, а также обсудить само понятие суспензионной (глубинной) культуры применительно к растительным клеткам. Безусловно, выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных клеток поверхностным способом.

 Здесь легче и более воспроизводимо влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами. Суспензионные культуры удобнее для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.

 Суспензионную культуру можно получить из фрагментов органа растения (диски запасающей паренхимы мясистых корней моркови, петрушки, клубней картофеля и др.), однако этот путь более трудоемкий и требует большего времени.

 Клетки экспланта должны при этом образовывать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии. Обычно для получения культуры клеток используется культура каллусной ткани. Рыхлые обводненные культуры каллусных тканей более пригодны для перевода в суспензию, чем структурированные плотные каллусы.

 Оптимальными подходами для получения суспензии являются выращивание каллусов на среде с 2,4-Д, исключение из среды ионов кальция, обработка пектиназой транспланта, предназначенного для вы- ращивания в суспензионной культуре.

 Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролифелирующая) часть каллусной ткани, а ее количество должно быть в 15−20 раз больше в расчете на объем питательной среды, чем при серийном культивировании на агаре.

 При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования, но в некоторых случаях увеличивают количество ауксинов и (или) уменьшают количество цитокининов.

Режим перемешивания и аэрации при инициации культуры клеток обычно такой же, как и при дальнейших серийных субкультивированиях культур клеток на роллерах и качалках (круговая качалка – 10−12 оборотов/мин).

№41

Образование первичной суспензии растительных клеток можно считать результатом трех процессов:

1) распадения каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду;

2) отделения клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований;

3) деления и роста клеток, образовавшихся по первым двум способам, и распадения разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки.

Последний процесс является типичным для роста стабилизировавшейся перевиваемой культуры клеток высших растений.

Первичную суспензию перед субкультивированием либо в специальном цилиндре разделяют на фракции по скорости седиментации (используют вехнюю фракцию), либо фильтруют через 1−2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов. Фильтрование рекомендуется и в нескольких последующих субкультивированиях до приобретения клеточной суспензией желательных ха- рактеристик. Однако агрегированность суспензии зависит не только от характеристик начальной линии, но и от условий культивирования. Для глубинного культивирования растительных клеток применяют способы, разработанные для микробиологических целей. Используют за- крытые или открытые системы в периодическом или проточном режи- мах. Хотя при глубинном выращивании растительных клеток принцип турбидостата практически не применяется. Одной из причин этого явля- ется разрушения части клеток при отводе их к оптическому прибору. Выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата применяется как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддерживающихся в разных фазах кле- точного цикла, так и при промышленном выращивании клеточной био- массы с целью получения экономически важных продуктов. Однако до настоящего времени наиболее изученным и распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. В этом случае для аэрации и пе- ремешивания суспензии используют роллеры, качалки (обычно круго- вые), ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры барботажного типа, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком.

№42

Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы.

Выделяют:

1) латентную (лаг) фазу, в которой видимый рост инокулята не наблюдается ни по одному из критериев. При этом наблюдается высокая интенсивность дыхания, максимальные значения энергетического уровня, интенсивный синтез ДНК, РНК, белков и других компонентов клетки, но низкий митотический уровень. Длительность периода адаптации зависит от количества и физиологического состояния инокулята и условий культивирования;

2) экспоненциальную фазу, характеризующуюся ростом с максимальной скоростью, максимальными величинами митотической активности, а также преобладанием мелких клеток меристематического типа;

 3) линейную, в течение которой скорость роста постоянна;

4) фазу замедленного роста, связанного с субстратным лимитированием и ингибированием продуктами обмена, характеризующуюся несбалансированным ростом популяции по основным критериям, снижением уровня дыхания, переходом части клеток в дифференцированное состояние, увеличением доли крупных вакуолизированных клеток, увеличением синтеза вторичных метаболитов (сердечных гликозидов, антрахинона, диосгенина);

   5) стационарную фазу, характеризующуюся еще малой скоростью деградации клеток, которая уравновешивается делением клеток, высокими биосинтетическими и биотрансформирующими потенциями жизнеспособных дифференцированных клеток, низким уровнем дыхания и появлением чрезвычайно крупных вакуолизированных клеток;

  6) фазу деградации клеток с удельной скоростью роста, принимаю- щей отрицательное значение. Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной.

Процессы ростового цикла зависят от вида растения, количества внесенного материала и условий куль- тивирования (состав питательной среды, температура, начальное значеие рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания). Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки исходных клеток растения и регулируется условиями выращивания. Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма, исчезновение одних и появление других стойких признаков, передающихся в ряду клеточных поколений, приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать или создать экспериментально линии, сохраняющие био- синтетические системы, характерные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципиально новые вещества.

 

 

№43

Протопласты растений – это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды, харак-еся структурной целостностью и способ-ю осущ-ть активный метаболизм и выполнять биосинтезы и трансформацию энергии.

 Термин был использован Д. Ханстеином в 1880 г. для обозначения морфологически обособленных образований при плазмолизе.

Наиболее простыми, но длительными и трудоемкими методами получения растительных протопластов являются механические.

При этом фрагмент растительной ткани вносят в 0,1 М раствор сахарозы, более концентрированный, чем вакуолярный сок, выдерживают определенное время до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от клеточных стенок, а затем аккуратно рассекают эпидермис, и протопласты выходят в среду. Однако при этом можно получить только ограниченное число прото- пластов и в этом случае использовать только те ткани, в которых возможен экстенсивный плазмолиз .

   Принцип-но отличный м-д получения изолированных протопластов − энзиматический. В этом случае для удаления клеточной стенки используются ферменты. Изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов впервые было успешно осущест-лено Е. Кокингом в 1960 г.

Он применил ферментный препарат из культуральной жидкости гриба Myrothecium verrucaria для получ. больших колич-в изолированных протопластов из кончиков корней томатов.

 Ферм-ное выд-ние протопластов имеет преим-ва:

 1) одновременно можно получить большое количество протопластов; 2) протопласты не подвергаются сильному осмотическому сжатию; 3) клетки более интакт- ны и не повреждены; 4) метод сравнительно быстрый.

 Для удаления клеточной стенки исп-ся ферментные препараты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы – чаще всего грибного или бактериального происхождения. В рез-те обработки тканей ферментными препаратами образуется смесь, содержащая протопласты, обломки разрушенных клеток и целые клетки.

Чтобы отделить протопласты от примесей, суспензию фильтруют ч\з нейлоновые ф-ры, а затем центрифуг- т в мягких условиях.

Источником клеток для получения протопластов явл-ся и клеточные суспензии и каллусные культуры.

Выделение протопластов легко выполнимая процедура, но сложно получить жизнеспособные протопласты и также их в дальнейшем культивировать. Успех зависит от мн.факторов – состава ферментов, их качества, рН среды, выбора осмотического раствора. значение имеет состояние растительного материала, а именно, его видовая, генетическая, энергетическая и физиологическая характеристики.

Для стаб-го получ-я большого количества протопластов важны станд-е усл-я выращив-я исх-х растений или клеток, определение оптим-го для выделения протопластов возраста растения, температуры, освещения, питания.

 Для получения прот-в из суспензионных клеточных культур лучшей явл-ся поздняя логарифмическая фаза роста, когда клеточные стенки лучше поддаются ферм-му разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.

№44

Для культивирования протопластов можно использовать метод жидких капель (К. Као и др., 1971).

В этом случае суспензия протопластов в виде капель в жидкой среде помещается в пластиковые чашки Петри. Метод обеспечивает хороший газообмен через воздушную фазу и диффузию в р-р экскретируемых продуктов.

Кроме того, легко можно добавлять свежий раствор в нужной концентрации. Однако при культивировании этим способом протопласты агрегируются в центре каждой капли. Накапливаясь, они образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений, что препятствует дальнейшему успешному культивированию.

Этот метод также неудобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов.

 Другой метод – агаровая культура (T. Нагата, И. Такебе, 1971). В этом случае определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же самой среды, содержащей 1 % агар-агара. Температура не должна превышать 45о С. Чашки заклеивают парафиллюмом и культивируют при температуре около 28о С.

Протопласты фиксированы в одном положении и физически отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество: можно наблюдать для одного конкретного протопласта все этапы его развития – формирование клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения. Недостаток этого метода заключается в том, что возможно некоторое повреждение протопластов при смешивании с теплым агар-агаром.

Одним из вариантов данной методики является использование «кормящих» протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или гамма-излучения (доза облучения выбирается такой, чтобы клетки утратили способность к клеточному делению, но поддерживали и стимулировали рост других клеток).

Они смешиваются с жизнеспособными протопластами и платируются. Этот метод позволяет культивировать суспензию протопластов более низкой концентрации, чем та, что обычно необходима для их роста.

 Сходным с этим методом является метод совместных культур. Он используется для эффективного культивирования труднокультивируемых протопластов. Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом. Успех такого культивирования основан на активных веществах, которые выделяются быстрорастущими видами.

 Удобным вариантом метода жидких капель является культивирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоля- ция). В микрокаплях, даже если в них находится только одна клетка, соотношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью около 1000 клеток/мл.

 По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур. Наиболее часто используют среды Мурасиге − Ску- га, модифицированную среду Нагата − Такебе, среду В5 Гамборга − Эве- лейта, и среду 8Р Као − Мичайлук, представляющую собой обогащенную витаминами, аминокислотами и сахарами среду В5 Гамборга.

 

 

№44

Все эти среды содержат минеральные вещества, являющиеся источниками макро- и микроэлементов, источники углерода, стабилизаторы осмотическо- го давления, витамины, фитогормоны. Поскольку центральная проблема при культивировании раститель- ных объектов на искусственных питательных средах – создание определенной буферной емкости смеси, то обычно используют сопряженные пары солей, в которые объединяют химически и физиологически кислые и щелочные соли.

 К основным сопряженным парам относятся соли, со- держащие азот и фосфор. Среды содержат железо в хелатной форме и сахарозу как источник углерода. Рекомендуется добавлять в среду сахара, входящие в состав клеточной стенки, а также ксилозу, рибозу и другие. Это стимулирует образование клеточной стенки.

Состав этих добавок может быть очень специфичным в зависимости от видовых особенностей протопластов.

Для индукции деления протопластов многих видов растений эффективно добавлять в среду ауксины – 2,4-Д, НУК, БАП, а также цитокинины – кинетин, зеатин, бензиладенин.

Температура культивирования является в значительной степени видоспецифичной и варьирует в достаточно широких пределах. При культивировании растительных протопластов температурный режим должен строго выдерживаться, т. к. обычно протопласты чувствительны даже к незначительным отклонениям от оптимальной температуры.

То же касается и интенсивности освещенности. Оптимальные значения освещенности могут варьировать от абсолютной темноты до яркого света.

Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов. При очень низкой плотности протопласты часто не делятся, в то время как при очень высокой плотности возникают затруднения на поздних этапах культивирования из-за появления в ростовой среде токсичных продуктов обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре составляет 103 −105 кл/мл.

Таким образом, используя разнообразные методы, учитывая характерные особенности исходного материала и соблюдая все условия, можно успешное осуществить культивирование растительных протопластов, добиваясь в отдельных случаях получения целого растения из единич- ных протопластов. Детальная разработка техники культивирования растительных клеток, получения и культивирования растительных протопластов послужила основой для создания методов биологического конструирования растений с заданными свойствами.

№45

Источником отдельных (одиночных) клеток явл-ся клеточные суспензии в жидкой питательной среде, мацерация тканей растений, изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки. Причем изолированные протопласты явл-ся идеальными отдельными клетками.

Культивирование отдельных клеток позвол. получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменч-ть при выращивании клонового материала.

От-е клетки важны для клоновой селекции мутантных, гибридных, трансформированных линий. Обычно в эти клетки вводят маркерные гены или создают маркерные признаки для обеспечения селективных условий отбора.  Мацерированные клетки ткани растения явл-ся хорошей моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и отдельной клетке.

Вместе с тем при культивировании этих клеток на среде, стимулирующей деление клеток, они диф-ся и образуют колонии каллусных клеток.

 Для получения отдельных мацерированных клеток исп-т специальные мацерирующие ферментативные препа- раты, содержащие мацеразу (полигалактуроназу), пектиназу, поливинил- пирролидон, сульфат калия, сорбит (маннит), 2-N-морфолино- этансульфоновую кислоту. Эта процедура производится в ламинарбоксе в усл-х строгой стерильности.

Отдельные клетки также могут быть получены из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюориметра или путем последовательных разбавлений. В этом случае суспензии готовятся разными способами: 1) 1−2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания основной массы клеток; 2) суспензию фильтруют через фильтры с уменьшающимся диаметром пор. Для последовательных раз- ведений используют платы для микротитрований, что позволяет микроскопически контролировать клеточный состав при последовательных разведениях.

Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, причем объем среды должен быть минимальным. Однако даже при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается очень низким.

Более эф-ны методы «кормящего слоя» или «ткани-няньки». Для создания «кормящего слоя» берут суспензию клеток того же вида растения. Клеточная суспензия должна нах-ся в ранней стадии ростового цикла. Каллусная культу- ра, служащая «тканью-нянькой», также должна быть в стадии активного роста. При достижении колонией, выросшей из отдельной клетки, разме- ра 0,5−1 мм, она может быть перенесена для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно либо на фильтр, помещенный на поверхность питательного агара. Использование «кормящего слоя», «ткани-няньки» или минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связано с явлением, называемым «действие фактора кондиционирования». Несмотря на многочисленные попытки определить природу веществ, индуцирующих деление отдельной клетки, и механизм действия фактора кондиционирования, данный вопрос окончательно не решен.  Изучение механизма взаимодействия клеток при размножении их в популяции − важная научная проблема, которая решается на уровне культивирования отдельных клеток.

№46

Первые опыты по культуре животных тканей были проведены немецким биологом В. Ру, которому удалось в 1885 г. в течение нескольких дней поддерживать развитие нервной пластинки куриного эмбриона в теплом солевом растворе.

 Однако лишь предложенная американским биологом Р. Гаррисоном в 1907 г. воспроизводимая техника послужила основой для дальнейшего развития метода культивирования животных клеток вне организма. Культивируя в сгустках лимфы небольшие кусочки нервной трубки эмбриона лягушки, Гаррисон через несколько недель наблюдал образование нервных волокон.

Французский хирург и патофизиолог А. Каррель, сумевший в течение 34 лет сохранять у штамма клеток сердца куриного эмбриона способность к активным делениям, доказал таким образом, что животные клетки могут неограниченно долго расти в культуре in vitrо. Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение в различных областях исследований − от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии.

Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и дифференцировки клеток, гистогенеза, межтканевых и межклеточных взаимодействий, обмена веществ и т. п. Культуры животных клеток являются важными продуцентами многих биологически важных веществ. На них выращивают вирусы для их идентификации и получения вакцин.

 Клеточные культуры часто применяют при тестировании и изучении механизма действия лекарст- венных и косметических средств, пестицидов, консервантов и т. п. Методы культуры клеток нашли широкое применение для реконструкции различных тканей и органов.

Так, культура клеток кожи используется для заместительной терапии при ожогах, культура клеток эндотелия − для реконструкции стенок сосудов. Способность клеток к росту в культуре привела к развитию методов клонирования, хранения и слияния клеток, что, в свою очередь, вызвало становление новой области науки − генетики соматических клеток.

Органные культуры используют при изучении закономерностей развития органов, для изучения способов сохранения жизнеспособности изолированных органов, предназначенных для трансплантации. В настоящее время практически любые клетки человека и животных могут быть введены в культуру и тем самым служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях.

 Наиболее часто культивируются следующие элементы: • соединительной ткани – фибробласты; • скелетной – кость и хрящи; • мышечной – скелетные, сердечные и гладкие мышцы; • эпителиальной – печень, легкие, кожа, мочевой пузырь, почки, молочная железа; • нервной – глиальные клетки и нейроны (хотя они лишены способ- ности к пролиферации); • эндокринной системы – гипофиз, надпочечники, клетки островков Лангерганса; • различные типы опухолевых клеток.

 

№47

Разл. 3 типа культур животных клеток: первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева; диплоидные культуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие диплоидный набор хромосом до 50 пересевов, которые затем трансформируются в постоянные (перевиваемые) гетероплоидные культуры, существующие вне организма десятки лет.

Клетки, полученные от животного, и поддерживаемые в культуре, называют первичными до тех пор, пока они не будут пассированы (субкультивированы), т. е. до первого пересева.

 Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются малым пролиферативным пулом, но в них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены и четко обнаруживается экспрессия ряда свойств, присущих данной ткани. Однако первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro.

Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной (0,01−0,05– 0,25 % трипсин, 200−2000 ед./мл коллагеназа) дезагрегации. В случае механической дезагрегации фрагмент ткани измельчают до кусочков размером около 1 мм, которые прикрепляются к субстрату благодаря собственной адгезивности, поверхности субстрата или сгустку плазмы. Ферментативная дезагрегация дает более высокий выход клеток, хотя метод является селективным, поскольку не все клетки переживают дис- социацию. На практике наиболее успешное получение первичных клеток из многих тканей связано с использованием коллагеназы, приводящим к снижению размера экспланта до небольшого кластера клеток, который прикрепляется к субстрату и распластывается. Культуры первичных клеток легко получить из многих тканей. Какое-то время эти клетки экспоненциально размножаются, но затем примерно через 6 месяцев скорость роста культуры снижается, а через 10 месяцев клетки деградируют и погибают. Это наблюдается примерно после 20−50 генераций (в зависимости от возраста тканей-источников пер-52 вичных клеток: из эмбриональной – 50, из взрослой – 20). На ранних стадиях клетки остаются эуплоидными, т. е. обладают правильным диплоидным набором хромосом, а позднее они становятся анеуплоидными.

 В некоторых случаях отдельные анеуплоидные клетки выживают и продолжают размножаться, что приводит к установлению клеточного штам ма. Частоту таких трансформаций можно увеличить, обработав клетки мутагенами или некоторыми вирусами. При успешном установлении культуры первичные клетки начинают размножаться и их необходимо периодически пересевать (субкультивировать). Субкультивирование обеспечивает возможность продления существования культуры (получение линии клеток), клонирования, исследования и сохранения клеток, а также получения более однородных популяций. Главным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.

№48

Оптимизация состава пит-х сред для культур животных клеток разв-сь в 2-х направлениях – разработка сред, требующих внесения природных добавок (сыворотки, эмбриональные экстракты и др.), и создание сред химически определенного состава.

В наст. время широко примен-ся ср., сод-щие источники энергии (углеводы) и азота; незаменимые аминокислоты; витамины; неорганические соли – источники макро- и микроэлементов, включая селенит; нуклеозиды; жиры и жирорастворимые компоненты; гормоны (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды, эстроген, андроген, тироксин, трииодтиронин); ростовые факторы (фактор роста, синтези- руемый тромбоцитами, фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса), а также сыворотку (до 10 %) и в ряде случаев некоторые дру гие добавки (бактопептон, триптозофосфат и т. п.). В 40−50-е гг. прошлого века большая часть клеток выращивалась в плазме или на фибриногеновом сгустке в присутствии тканевых экстрактов или их ультрафильтратов. Начиная со среды 199, предложенной Г. Моргоном в 1950 г. и содержащей более 60 синтетических ингредиентов, широко осуществляется подбор состава и методов приготовления различных питательных сред.

В своей работе в 1955 г. Х. Игл исследовал потребности клеточных линий мышей L и HeLa в питат-ных веществах. Это злокач-ные клетки, характ-еся различным кариотипом и сходные по своей морфологии с клетками плоского эпителия. Х. Игл использовал среды определенного состава, содержащие смесь аминокислот, витаминов, солей и углеводов, а также небольшое количество диализированной сыворотки лошади или человека. В ходе исследований 27 факторов были определены как незаменимые для роста. Они составили основу среды, известной как «базальная среда Игла», или БСИ. Из 20 аминокислот 13 оказались незаменимыми, а остальные 6 могли быть синтезированы клетками из других источников углерода. Удаление любого из 7 витаминов приводило к развитию симпто мов недостаточности. Таким образом, Х. Игл, используя метод культи- вирования клеток, продемонстрировал питательные потребности клеток мыши и человека. Вскоре БСИ была заменена минимальной средой Игла (МСИ), в которой концентрация различных компонентов была повыше- на, что обеспечивало непрерывный рост клеток в культуре в течение не- скольких суток без смены среды. Указанные среды широко используются для культивирования различных клеточных линий. Сыворотка в их составе служит источником неидентифицированных факторов. До сих пор нет общего мнения относительно роли сыворотки в клеточных культурах, как и относительно физиологической роли некоторых ее компонентов. Считается, что сыворотка обеспечивает клетки гормональными факторами, стимулирующими их рост и ф-ции, служит источником низкомолекулярных соединений,  а также обесп-ет клетки незаменимыми соединениями.

В конце 1950-х гг. было показано, что ά-глобулиновая сывороточная фракция (фетуин) способс-ет прикреплению клеток к стеклу и их распластыванию, т. е. процессам, необходимым для размножения клеток. В сыворотке содержатся коллаген и фибронектин. В 70-х гг. заинтересовала роль сывороточ-го альбумина в культурах в связи со способ-ю его служить переносчиком для неболь-х молекул гормонов, которые могут стимулировать in vivo или in vitro рост различных типов клеток.

№48

Однако культивирование клеток в присутствии сыворотки обнаруживает ряд недостатков:

 1) для большинства клеток сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани;

 2) часто недооценивается возможность цитотоксичности сыворотки;

 3) сыворотки могут содержать недостаточное количество специфических для данного вида клеток ростовых факторов;

4) возможны изменения свойств сыворотки от партии к партии.

В настоящее время предпринимаются попытки создания и применения бессывороточных питательных сред, в которых сыворотка заменяется смесью гормонов (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды и др.) и ростовых факторов.

Эти среды необходимы, если по условиям экспери- мента требуется избежать присутствия чужеродного белка и из-за высокой стоимости эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота.

Однако в настоящее время бессывороточная среда имеет существенные недостатки: добавление в дешевую среду гормонов и факторов роста делает ее такой же дорогой, как среда с сывороткой.

 Кроме того, чаще всего бессывороточные среды пригодны для ограниченного числа клеток.

Одна из проблем, возникающих при попытках получить культуры одиночных клеток или культуры клеток с низкой плотностью (100 кл\мл), заключается в том, что в этих условиях клетки погибают или растут очень медленно.

 В результате подробных исследований была раз- работана концепция «кондиционированной среды», т. е. среды, в которой концентрация метаболитов находится на таком уровне, что наступает равновесие между выходом метаболитов из клеток в среду и обратным захватом этих метаболитов клетками.

№49

Типы культуральных систем

Непроточные культуры. Обычный тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. Эти системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста клеток в среде культивирования происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов – следовательно, среда должна постоянно меняться, что, в свою очередь, приводит к изменению клеточного метаболизма (физиологической дифференцировке).

Системы непроточных культур характеризуются в той или иной степени накоплением отходов и непостоянством внешних условий.

 Способы увеличения продолжительности жизни культур: а) прерывистый – часть культуры заменяется равным объемом свежей среды; б) постоянный – объем культуры постоянно увеличивается с низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются; в) перфузионный – постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточ- ной среды.

Проточные культуры. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительно периода, что имеет очень важное значение в физиологических исследованиях. Однако использование таких культур для получения кле- точных продуктов невыгодно с экономической точки зрения. Системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

 

 

№50 Постоянные культуры

 После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет (ограниченная линия клеток), либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией.

 Различия в свойствах этих клеток и большой период времени, предшествующий их появлению (иногда несколько месяцев), позволяет предположить мутационную природу появления клеток постоянной культуры (стволовые клетки).

Нельзя исключить и возможность существования «бессмертных» клеток, особенно в культурах, полученных из опухолей.

Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения), по увеличению скорости роста (время удвоения клеток снижается в 1,5−3 раза), по снижению зависимости от сыворотки и возможности поддержания в более простых средах, по снижению зависимости от субстрата и, следовательно, их способности к росту в суспензии; по увеличению гетероплоидности и анеуплоидности, а также по увеличению опухолеродности.

Однако нормальные клетки, спонтанно трансформируясь в постоянную линию, не становятся при этом злокачественными (несмотря на некоторые черты сходства).

Таким образом, постоянные клеточные линии имеют определенные преимущества: высокая скорость роста, возможность достижения более высокой плотности и, следовательно, более высокого выхода биомассы;  возможность использования более дешевых сред; способность к суспензионному росту. Но также они имеют и недостатки – повышенная хромосомная нестабильность, отклонение от фенотипа донора, утрата специфических маркеров.

 исследователи определяют штамм клеток как популяцию клеток, полученную из первичной культуры путем пересева, а под линией клеток понимают клеточную популяцию, полученную из первичной культуры и выращиваемую неопределенно долгое время in vitro.

№51 Монослойные культуры

Требов. к пов-ти субстрата. Большинство нетрансформи- рованных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату: к другим клеткам либо к стеклу (алюмоборосиликатное стекло, чаще модифицированное), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и др. при усл. правильной обр-ки этих полимеров – пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу (качественная нержавеющая сталь или титан).

Поверх-ти клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхностной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами (наиболее изученным является фибронектин, присутствующий в сыворотке и других физиологических жидкостях), а также присутствие двух- валентных катионов кальция и магния. Суммарный отрицательный заряд поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно заряженных карбоксильных групп) может достигаться предварительным воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факторами (высоковольтный разряд, облучение УФ), что облегчает электростатическое прикрепление клеток.

 Поверхность культурального сосуда может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление клеток. К природным субстратам, на которых растут клетки, относятся коллаген и желатин.

Культуральная посуда. Монослойное культивирование осуществляют во флаконах (флаконы Ру – самые большие стационарные флаконы поверхностью до 200 см2 ) или пробирках для культуры тканей, обеспечивающих поверхность роста 5−200 см2 .

Рост клеток в монослое. В случае монослойных культур необходимо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в условиях консервации. Полноценная популяция может быть получена только от генерации, состоящей из жизнеспособных клеток. Поэтому просмотр и оценка качества монослоя имеют решающее значение при выборе культур для пересева.

Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфические движения клеточной мембраны. Первичные клетки, следовательно, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений.

№51

 Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в та- ком покоящемся состоянии, но если их не пересеять, они погибают.

 Из сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способностью снимать контактное торможение. Снижение распластывания клеток при достижении полного монослоя, а также ошаривание и прекращение роста клеток при их откреплении от подложки легли в основу представлений о тесной связи распластывания нетрансформированных клеток по мере их роста.

 Ослабленным контактным торможением характся клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности. Трансформированные клетки сп-ны расти до истощения среды, и если не натупает смена среды, то клетки быстро погибают.

Одним из ф-ров, лимит-щим рост клеток, явл-ся истощение в среде необх-х питательных компонентов.

След-но, для получения высокой плотности клеток необходима периодическая замена питательной среды, а это может приводить к постоянному изменению состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно. Процесс подг-ки клеточного монослоя к отделению от стекла и формированию суспензии (обработка клеток в монослое 0,02 % раство- ром химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА) происходит при комн. темп-ре в теч. 5−10 мин в зав-ти от типа культуры и ее индивид. состояния. Когда клеточный монослой достаточно разрыхляется и начин. отд-ся от стекла, раствор фермента сливают, а в культуральную посуду залив-т опред-ное кол-во ростовой среды.

Этой средой тщ. смывают клетки со стенки сосуда и легким пипетированием способствуют образованию гомогенной взвеси. Полученную взвесь после подсчета числа клеток разводят ростовой средой до посевной дозы и используют при новых пересевах.  

Монослойные к-ры имеют ряд преимуществ: 1) выделение секретируемого продукта многими клетками осуществляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату; 2) возможность быстрой и легкой замены питательной среды, сопоставления времени и количества среды с периодом роста клеток или временем наработки продукта; 3) обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в монослой могут быть введены любые типы клеток; 4) достижение искусственно высокой плотности клеток с использованием перфузионной техники; 5) возможность использования одной и той же аппаратуры с разным отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

Однако при использовании монослойных культут выявляются и недостатки: 1) сложность масштабирования; 2) отсутствие информативности визуального анализа; 3) трудности с определением и поддержанием таких параметров, как кислотность и содержание О2, и обеспечением гомогенности культуры клеток; 4) необходимость значительных пространств.

№52Суспензионные культуры

 Для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры.

Как пр-ло, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют.

Но если некоторые клетки культивировать во вра- щающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу, предотвращающую агрегацию клеток, можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы.

Иногда этого бывает достаточно для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния. Суспензионные культуры также можно получать путем обработки отобранной для пересева монослойной клеточной культуры 0,02 % раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА с последующим длительным периодом адаптации, сопровождающимся различными манипуляциями, предотвращающими возврат к монослою.

Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд наполнен средой наполовину. Для обеспечения этих условий необх. каждый день или (в случае медленно растущих культур) через день, удалять половину суспензии через боковое горлышко и добавлять равный объем свежей среды.

Некот. клетки (трансформированные и кроветворные клетки, асцитные опухоли) сп-ны расти как на субстрате, так и в суспензии в зав-ти от солевого состава среды культивирования.

Культуры лимфоцитов не обнаруживают тенденции к адгезии к поверхности стекла или пластика и выживают на дне культивационного сосуда под тонким слоем среды. Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых клеточных линий проводят в роллерных установках, где создаются благоприятные для клеток условия постоянного перемешивания жидкой и газовой фаз, общий объем среды при этом снижается вдвое по сравнению со стационарными условиями.

 Суспензионное культивирование клеток также можно проводить в ферментерах, предназначенных для суспензионного культивирования микроорганизмов, в которых постоянное перемешивание клеток в среде осуществляется магнитными или механическими мешалками в колбах с высокой скоростью вращения, препятствующей прикреплению клеток к стенкам сосудов. Суспензионное культивирование дает, по меньшей мере, 2−3-кратную экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорого- стоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы.

 

 

№53

   Термин «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхно­сти горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой.

Многочисленность клеточной культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки.

Для роллерного культивирования используются специальные стеллажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны.

 Чаще всего для культивирования используют 0,5—3-литровые бутыли. В производст­венных условиях объем их может достигать 20 литров и более.

Аппараты для роллерного культивирования просты, надежны и обслуживание их не­сложно.

Большое значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания.

Роллерный метод культивиро­вания позволяет получить большее количество клеток. Способно­стью к росту и размножению в роллерных условиях обладают субкультуры, перевиваемые культуры и реже первичные, а также диплоидные штаммы клеток.

Для лучшего размножения клеток в роллерных аппаратах необхо­дима адаптация их к новым условиям культивирования.

Роллерный метод культивирования позволяет получить большие количества клеток. Преиму­ществом роллерных культур по сравнению с традиционными стационарны­ми культурами является, в частности, более экономичное использование питательных сред и более высокий выход вирусного антигена (на 1—2 lg).

№54

Монослойное культивирование на микроносителях.

Сочетать положительные стороны монослойного и суспензионного культивирования позволяет использование системы с микроносителями. Микроносители – мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспензии благодаря перемешиванию), на поверхности которых клетки растут в виде монослоя.

Использование микроносителей дает клеткам, обладаю- щим адгезивными свойствами, все преимущества крупномасштабных суспензионных культур.  Микроносители должны быть нетоксичными, не сорбировать компоненты питательных сред и продукты метаболизма клеток, а также иметь поверхностный заряд или обменную емкость, достаточную для прикрепления клеток.

 Коммерческие микроносители имеют диаметр 100−200 мкм и подразделяются на 6 основных групп:

 1) декстрановые микроносители, поперечно сшитые, типа Cytodex 1;

2) декстрановые микроносители типа Cytodex 2;

 3) микроносители, покрытые коллагеном или желатином, типа Cytodex 3;

4) полистиреновые микроносители типа Biosilon, Cytospheres;

 5) стеклянные микроносители типа Bioglass;

6) целлюлозные микроносители типа ДЕ-53. Используемые в настоящее время микроносители на основе микропористого желатина или пористого боросиликатного стекла имеют емкость около 3000 клеток/микроноситель.

№55

В настоящее время известно около 150 перевиваемых линий клеток беспозвоночных, наибольшее число из которых получено от насекомых.

 Среды для культивирования клеток и тканей насекомых сильно варьируют по составу. При составлении питательных сред часто руководствуются данными по составу гемолимфы, различающейся у разных видов насе- комых.

 В настоящее время предложено более 50 вариантов питательных сред для культивирования клеток беспозвоночных.

Все эти среды отличаются от сред для клеток млекопитающих наличием органических кислот, повышенным содержанием аминокислот и более высоким осмотическим давлением.

Ни одна из этих сред не пригодна для получения культур клеток всех видов беспозвоночных, т. е. не является универсальной.

Для получения культур клеток насекомых часто берут эмбриональные клетки.

 Первичные культуры служат источником для получения длительно пересеваемых линий клеток беспозвоночных.

С помощью методов первичного культивирования клеток удается исследовать дифференцировку и метаболизм клеток беспозвоночных в культуре. После длительного периода адаптации клеток к условиям культивирования удается проводить пересев клеток.

 Обычно период адаптации занимает 3−10 месяцев от момента эксплантации клеток в первичную культуру.

 В настоящее время получен целый ряд пересеваемых линий клеток из различных тканей, взятых на разных стадиях развития беспозвоночных животных.

Культуры клеток беспозвоночных животных представляют огромный интерес для изучения молекулярных механизмов взаимодействия хозяин − паразит, роли мобильных генетических элементов в адаптации беспозвоночных к стрессовым ситуациям окружающей среды, регуляции действия генов в клетках высших организмов и клеточных механизмов дифференцировки и т. д.