Работа № 2. Определение гематокрита

Гематокрит – это показатель, характеризующий соотношение форменных элементов и плазмы крови. Гематокрит – доля объема крови, которую

занимают форменные элементы. Он определяется в ходе центрифугирования цельной крови в капилляре в специальной центрифуге.

 

Ход работы

Для определения гематокрита произведите забор крови из пальца (работа № 1) в специальный капилляр. Капилляр обязательно обработайте антикоагулянтом – гепарином или раствором цитрата натрия. Капилляр заполните кровью на ⁷/₈ его длины (при этом в капилляр не должны попадать пузырьки воздуха). Закупорьте его специальной замазкой с того конца, через который брали кровь. Поместите капилляры с кровью в ротор центрифуги таким образом, чтобы закупоренные концы были направлены кнаружи от оси вращения и упирались в резиновую прокладку. Центрифугируйте в течение 5 минут. Определите гематокрит (Г) по специальной шкале или с помощью линейки. В последнем случае измерьте высоту столбика эритроцитов (В_э) и высоту столбика плазмы (В_п). Рассчитайте гематокрит (как процент форменных элементов от всего объема крови) по формуле:

В_э

Г = –––––––– × 100.

В_э + В_п

Рекомендации по оформлению протокола работы:

Полученные результаты определения гематокрита занесите в протокол опытов, оцените их, исходя из того, что показатели нормы гематокрита для здорового человека таковы: 43 % для женщин, 45 % – для мужчин. Такое состояние носит название нормоцитемии. Если относительный объем форменных элементов составляет менее 43%, то это признаки олигоцитемии, если более 45 %, то полицитемии. Увеличение гематокрита наблюдается при эритроцитозе, уменьшение – при эритропении или микроцитозе (уменьшение размера эритроцитов) на фоне неизменной концентрации эритроцитов. Теоретически гематокрит должен увеличиваться при макроцитозе (увеличение размера эритроцитов), но последний наблюдается только на фоне выраженнойэритропении.

Новорожденные имеют высокий гематокрит, составляющий в среднем 57 %. Дальнейшая динамика этого показателя соответствует изменениям количества эритроцитов в периферической крови.

 

Знакомство с устройством камеры Горяева

Камера Горяева представляет собой специальное устройство для подсчета форменных элементов крови. На ее поверхность нанесена сетка, разделяющая пространство на квадраты: большие и маленькие.

 

Рис. 5. Камера Горяева: а – вид сверху; б – вид сбоку; в – сетка

 

Камера Горяева представляет собой толстое прямоугольное стекло с двумя сетками, выгравированными на его поверхности (рис. 5). Сетки отделены одна от другой поперечной канавкой во избежание затекания жидкости. Двумя глубокими продольными канавками сетки отделены от стеклянных прямоугольных пластинок, к которым притирают шлифованное покровное стекло. Плоскость поверхности этих пластинок находится на расстоянии 0,1 мм выше плоскости, в которой нанесены сетки. Камера состоит из 225 больших квадратов. Сто квадратов не разлинованы; каждый 25-ти больших квадратов разделен каждый на 16 малых объемом 1/4000 мкл. Во избежание двукратного подсчета клеток, находящихся на линиях сетки, пользуются правилом буквы «Г»: считаются клетки, относящиеся к данному квадрату и лежащие внутри него и на левой и верхней границе; клетки, пересекающие правую и нижнюю границу, не подсчитываются.

 

Работа № 3. Определение количества эритроцитов в крови Задание 1. Подсчет количества эритроцитов в камере Горяева

 

Принцип метода состоит в подсчете эритроцитов в камере Горяева. Для уменьшения концентрации форменных элементов и создания удобной для подсчета их концентрации кровь предварительно разводится стандартным образом.

Ход работы

Пипеткой отмерьте 4 мл разводящего раствора (3,5-процентный раствор NaCl) и вылейте в сухую пробирку. Капилляр Сали обработайте раствором цитрата натрия.

Из прокола пальца (работа № 1) выпустите свежую каплю крови, приставьте к ней кончик капилляра Сали и наполните его до отметки 0,02. Это соответствует объему 0, 02 мл, или 20 мкл. Вытрите кончик капилляра и выпустите кровь в пробирку с разводящим раствором. Полученное таким образом разведение крови – 1:200.

После тщательного перемешивания раствора крови небольшой каплей заполните подготовленную с притертым стеклом камеру Горяева. Предварительно камеру промойте водой и насухо вытрите. На участок камеры, где нанесены сетки, уложите обезжиренное покровное стекло, при этом нижняя поверхность камеры должна находиться на третьих пальцах обеих рук, двумя вторыми пальцами придерживайте ее спереди. Двумя пальцами притрите покровное стекло, плавно продвигая его по поверхности прямоугольных пластинок до появления цветных колец Ньютона в местах соприкосновения покровного стекла с поверхностью пластинок камеры.

Каплю исследуемой жидкости пипеткой поместите перед щелью, образованной покровным стеклом и пластинкой камеры Горяева с нанесенной сеткой. Капля должна заполнить камеру самотеком (под действием капиллярных сил). Следите, чтобы в пространстве над сеткой не было пузырьков воздуха и избытка жидкости.

До начала подсчета оставьте счетную камеру на 1-2 мин для осаждения форменных элементов. Камеру положите на столик микроскопа и настройте его на малое увеличение (объектив в 8-9 раз, окуляр - в 10 или 15 раз). Подсчет производите при несколько опущенном конденсоре. Хорошую контрастность обеспечивает фазово-контрастное устройство. Эритроциты считайте в пяти больших квадратах, состоящих из 16-ти малых (5x16 = 80), расположенных по диагонали. Для записи результатов рекомендуется предварительно начертить на листе 5 больших квадратов, разлинованных на 16 клеток, записывать найденное число эритроцитов в каждую из них. При подсчете необходимо помнить правило буквы «Г».

Подсчитав число эритроцитов в 80-ти маленьких квадратах (N), рассчитывают число клеток в 1 мкл (мм³) крови (X). Для этого учитываются разведение в 200 раз, объем камеры над одним маленьким квадратиком в 1/4000 мкл и то, что клетки подсчитывались в 80-ти таких квадратах. Таким образом, формула для вычисления количества эритроцитов следующая:

Nх4000х200

80

Полученное количество эритроцитов можно также выразить в количестве на 1л крови (умножением полученного количества на 10⁶), что является стандартной размерностью этого показателя. Рекомендации по оформлению протокола работы

Выводы делаются исходя из того, что в норме количество эритроцитов должно быть таким: 3,6-4,5-10¹²кл/л - для женщин; 4,5-510¹²кл/л - для мужчин. После небольшой нагрузки - 5-5,5-10¹²кл/л.

Сразу после рождения количество эритроцитов составляет около 6,010¹²кл/л (допускаются колебания в пределах 5,4-7,2-10¹²кл/л). С конца первых - начала вторых суток жизни обычно происходит снижение числа эритроцитов в крови, наиболее выраженное на 5-7-й день. Минимального значения этот показатель достигает к 2-3 мес, а затем несколько увеличивается и в дальнейшем (с 5-6-го мес.) поддерживается на уровне взрослых.

Если количество эритроцитов выше нормы, то это явление называется эритроцитозом, если оно меньше, то налицо эритропения, или анемия. Увеличение количества эритроцитов в крови (эритроцитоз) встречается при ложном эритроцитозе), а также при усилении эритропоэза на фоне неизменной интенсивности гемолиза (истинный эритроцитоз). Уменьшение количества эритроцитов в крови может наблюдаться при гемодилюции

(ложная эритропения).

 

Задание 2. Подсчет количества эритроцитов электрокалориметрическим способом

 

Пипеткой отмерьте 8 мл разводящего раствора (3,5-процентный раствор NaCl), перенесите в сухую пробирку. Далее добавьте 1 капилляр Сали крови, что составляет 20 мкл.

Затем измерьте оптическую плотность на ФЭКе при красном светофильтре в кювете толщиной 10мм. Предварительно нужно выставить ноль по разводящему раствору. Показания снимайте по левой красной шкале.

Полученный результат оптической плотности нужно умножить на 10⁷, в итоге получается количество эритроцитов в 1 мкл (мм³) крови.

Рекомендации по оформлению протокола работы

Полученную величину сопоставьте с нормальными показателями, оцените функциональное значение эритроцитов в переносе газов крови.