Работа № 6. Определение количества лейкоцитов в крови

 

Определение количества лейкоцитов, как и эритроцитов, осуществляется в камере Горяева. Разведение крови производят в 20 раз 3–5процентной уксусной кислотой. При этом эритроциты разрушаются и не мешают счету.

Ход работы

Пипеткой отмерьте 0,4 мл разводящего раствора (3–5-процентного раствора уксусной кислоты), подкрашенного метиленовым синим, и перенесите в чистую пробирку.

Забор крови производите в соответствии с правилами, описанными выше («Физиология красной крови», лабораторная работа № 1). Кровь забирайте в капилляр Сали, наполняя его самотеком до метки (0,02).

Кончик капилляра вытрите и перенесите кровь в пробирку с разводящим раствором. Получается разведение 1:20.

Подсчет количества лейкоцитов производите в пяти больших квадратах камеры Горяева («Физиология красной крови», лабораторная работа № 1).

Расчет количества лейкоцитов Х в 1 мкл крови осуществляется с учетом разведения, объема камеры и числа подсчитанных квадратов:

Nх4000х200 Х

80

Полученное количество лейкоцитов обычно выражают в количестве на 1л крови (результат умножается на 10⁶).

Рекомендации по оформлению протокола работы

Результаты занесите в тетрадь протоколов опытов. Сделайте выводы, исходя из того, что в норме у взрослого человека содержание лейкоцитов в крови составляет 4-9-10⁹кл/л, при мышечной работе - 18-10⁹кл/л.

Увеличение количества лейкоцитов в крови называется лейкоцитозом, а уменьшение - лейкопенией. Снижение количества лейкоцитов в крови всегда имеет патологический характер. Повышение количества лейкоцитов в крови может быть физиологическим, то есть возникать у здоровых людей (лейкоцитоз пищевой, миогенный, при беременности), и патологическим. Число лейкоцитов в периферической крови в первые 5 дней жизни составляет 18-20-10⁹кл/л, в двухнедельном возрасте снижается до 9-1210⁹кл/л, а в последующие периоды онтогенеза не отличается от уровня у взрослых.

 

Работа № 7. Изучение морфологии лейкоцитов

 

          Исследование      морфологии      лейкоцитов      производят

микроскопированием мазков крови, окрашенных по Романовскому. Принцип метода окраски мазков состоит в избирательном поглощении веществами клетки трех красящих веществ – азура, метиленового синего и эозина. Азур имеет амфотерно-основную реакцию, метиленовая синька – щелочную, эозин – кислую.

 

Задание 1. Приготовление мазков крови

 

Ход работы

Каплю крови поместите на край чистого обезжиренного предметного стекла и сделайте мазок с помощью другого предметного стекла со шлифованным краем. Вторым предметным стеклом со шлифованным краем прикоснитесь к капле крови и, как только капля, коснувшись подвижного стекла, разойдется по линии соприкосновения стекол, верхним стеклом, держа его под углом 45° (рис. 6), проведите по первому стеклу в направлении от капли, чтобы получился мазок. Мазок должен быть достаточно тонким, чтобы клетки крови расположились в один слой; в то же время следует избегать чрезмерного надавливания (для избежания деформации лейкоцитов). Приготовленные мазки высушивают на воздухе, а затем фиксируют и окрашивают с использованием нескольких способов.

 

Рис. 6. Приготовление мазка крови

 

Задание 2. Фиксация и окраска мазков

 

Ход работы

Есть два способа фиксации и окраски мазка.

Способ 1. Свежеприготовленный, высушенный на воздухе мазок зафиксируйте метиловым или этиловым спиртом. Для этого мазок поместите горизонтально в ванночку на подставки и капайте спирт так, чтобы он полностью покрывал мазок крови. Подождите несколько минут до испарения спирта.

Окраску фиксированных мазков производите свежеприготовленным водным раствором краски Романовского-Гимза. Для этого на 1 мл воды добавьте одну каплю краски (~40мкл). Для получения хорошей окраски значение рН воды должно составлять ~6,8–6,9. Поэтому желательно использовать вместо воды фосфатный буфер с рН – 6,8–6,9. На один мазок потребуется 2–3 мл водного раствора краски.

Окрашивание производите нанесением водного раствора краски каплями на горизонтально расположенный на подставках в ванночке мазок (до полного покрытия мазка). Красьте в течение 15–20 мин, после чего смойте краску холодной водопроводной водой и высушите мазок на воздухе.

Способ 2 (ускоренный). При окраске мазка ускоренным способом мазок не фиксируется предварительно. Свежеприготовленный, высушенный на воздухе мазок поместите горизонтально в ванночку на подставки и наносите неразведенную краску Романовского – Гимза каплями, чтобы она полностью покрывала мазок крови, при этом капли считайте. Подождите 2 мин и после этого нанесите столько же капель дистиллированной воды. Смешайте воду с краской аккуратным покачиванием мазка и красьте 10 минут. После этого краску смойте холодной водопроводной водой и высушите мазок на воздухе.

Окрашенный и высушенный мазок исследуйте под микроскопом с иммерсией. На мазок нанесите каплю иммерсионного масла, осторожно опустите объектив (х90) до соприкосновения с маслом, затем объектив приподнимите на 1 мм. При этом силы поверхностного натяжения удерживают масло в контакте с линзой. После этого настройте поле зрения, медленно опуская объектив до появления контуров клеток. Для окончательной фокусировки используйте микровинт.

В поле зрения (рис. 7) основную площадь занимают безъядерные эритроциты и от одного до нескольких лейкоцитов с ядрами. Лейкоциты крупнее эритроцитов по размерам; ядра окрашены в фиолетовый цвет.

Нейтрофилы имеют бледно-розовую цитоплазму с нейтрофильными гранулами, окрашивающимися в розово-фиолетовый цвет. Форма ядра нейтрофилов зависит от их зрелости. Палочкоядерные нейтрофилы, являющиеся более молодыми клетками, имеют ядро в виде изогнутой палочки. У зрелых нейтрофилов ядро вследствие перекручивания разделено на ряд сегментов, связанных очень тонкими, иногда почти незаметными нитями. Это полиморфноядерные, или сегментоядерные, нейтрофилы.

 

Рис.7. Морфологические особенности лейкоцитов крови: 1 – базофил; 2, 12 – эритроциты; 3 – эозинофил; 4, 7 – моноциты; 8, 9, 10 – лимфоциты; 5 – палочкоядерный нейтрофил; 6 – сегментоядерный нейтрофил; 11 – тромбоциты

 

У эозинофилов и базофилов цитоплазма окрашена очень слабо. Эозинофилы имеют ярко окрашенные красные гранулы, окрашивающиеся эозином. Ядро эозинофилов по структуре близко к ядру нейтрофилов: более молодые клетки имеют палочковидное ядро, более зрелые – сегментированное. Однако сегментация ядра выражена меньше. Ввиду относительной малочисленности эозинофилов учет палочкоядерных и сегментоядерных форм в отдельности не производится.

Базофилы в цитоплазме содержат крупные темные фиолетовые или ультрамариновые гранулы, часто закрывающие отдельные участки ядра.

Ядро базофилов неправильной формы, окрашивается в фиолетово-розовый цвет.

Лимфоциты и моноциты, составляющие группу агранулоцитов, не содержат зернистости в цитоплазме. Клетки лимфоцитов округлые, с круглым или овальным ядром, которое окружено или очень узким (малые лимфоциты), или более широким (средние и большие лимфоциты) пояском цитоплазмы. Цитоплазма лимфоцитов голубая. Часто она видна лишь с одной стороны от ядра (в виде серпа). В некоторых клетках и этот серп незаметен, и тогда малый лимфоцит имеет вид «голого ядра».

Моноциты крупнее лимфоцитов, большей частью круглой, иногда неправильной формы, с хорошо выраженной цитоплазмой. Цитоплазма моноцитов серо-голубая. Ядро сравнительно велико и имеет выступы и углубления. Обычно оно «бобовидной» формы. Интенсивность окраски ядра моноцитов слабее, чем лимфоцитов.

Двигаясь по мазку, исследуйте лейкоциты в каждом поле зрения. При этом рекомендуется пересекать мазок по схеме, представленной на рис. 8.

 

Рис.8. Схема движения по мазку крови при исследовании морфологии лейкоцитов

Произведите исследование 100 лейкоцитов, идентифицируя каждый лейкоцит; подсчитайте количество лейкоцитов в каждом классе. Поскольку исследуется 100 клеток, результаты выражаются в процентном количестве лейкоцитов каждого типа среди всех лейкоцитов крови.

Рекомендации по оформлению протокола работы

Результаты внесите в таблицу и сопоставьте полученные результаты с нормой. В случае отклонения количества определенных типов лейкоцитов от нормы сделайте вывод об относительном нейтрофилезе или

нейтропении, эозинофилезе или эозинопении и т. д. (таблица).

 

Таблица. Морфологический состав лейкоцитов крови в %

(лейкоцитарная формула)

Количество, %	Палочкоядер ные нейтрофилы	Сегментоядерны е нейтрофилы	Эозино филы	Базофилы	Лимфоциты	Моноциты
Норма	2-5	55-68	1-4	0,25-0,75	25-30	6-8

 

Таблица. Изменения морфологического состава лейкоцитов крови

Содержание, %	Нейтрофилы	Эозинофилы	Базофилы	Лимфоциты	Моноциты
Увеличение	Нейтрофилез	Эозинофилез	Базофилез	Лимфоцитоз	Моноцитоз
Снижение	Нейтропения	Эозинопения	Базофилопения	Лимфопения	Моноцитопения

Для вывода о морфологическом составе лейкоцитов крови процентного выражения часто оказывается недостаточно и используется пересчет на абсолютное содержание клеток крови, исходя из подсчитанного количества всех лейкоцитов в крови. При отклонениях морфологического состава в абсолютных единицах от нормы (таблица) делается вывод об абсолютном нейтрофилезе или нейтропении и т. д.

 

Таблица. Морфологический состав лейкоцитов крови в абсолютных

единицах (лейкоцитарный профиль)

Количеств о, кл/л	Палочкоядерн ые нейтрофилы	Сегментоядер ные нейтрофилы	Эозинофилы	Базофил ы	Лимфоциты	Моноциты
Норма	180-400	3065-5600	100-250	1-75	1200-2800	200-600

Сделайте общее заключение о защитной роли лейкоцитов.