Изучение методики промышленного культивирования простейших в курсе «Общая биология»

Курс «Общая биология» в соответствии со стандартом подготовки бакалавров биологии предусматривает лекционные и лабораторные занятия. В рабочую программу дисциплины включено три занятия по теме

«Культивирование простейших в лаборатории». Методы, используемые на этих занятиях способствуют формированию приемов, умений и навыков организации поисковой и исследовательской работы, самостоятельной познавательной деятельности, проведения опытов.

Биологическое образование охватывает большой круг естественнонаучных исследований. С развитием биологии представление о биотехнологии менялось.

В компетенцию биотехнологии входит культивирование (разведение) клеток, тканей, организмов в целях практического их использования, основанное на знании общебиологических закономерностей.

Постановка лабораторной культуры, разведение простейших как элемент биотехнологии. способствует вовлечению студентов в процесс познания живой природы, изучению тонких взаимоотношений в биоценозах. Клеточные культуры с каждым годом находят все большее применение в самых разнообразных областях биологии, медицины и сельского хозяйства. Их используют при решении таких общебиологических проблем, как выяснение механизмов дифференцировки и пролиферации, взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, биологической подвижности, злокачественной трансформации и многих других. Важная роль отводится клеточным культурам в биотехнологии при производстве вакцин и биологически активных веществ. Они являются исходным материалом для создания клеток-продуцентов, используются в целях повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и для выведения новых сортов растений. Культуры клеток применяются для диагностики и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест - объектов при испытании новых фармакологических веществ, а также для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений. Одноклеточные простейшие используются в качестве объектов биологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды. Протисты используются как компонент активного ила при биологической очистке сточных вод

В настоящее время зоокультура беспозвоночных перспективна в разных направлениях: в частности, есть опыт культивирования свободноживущих простейших (инфузорий) в целях индустриального рыбоводства; дождевых

червей для улучшения плодородия почв; личинок домашней мухи – для утилизации навоза и производства белка

Задачей данной темы является формирование у студентов биологов понятия культивирования одноклеточных простейших, как сложного и многопланового технологического процесса, состоящего из ряда последовательных этапов. Это особенно важно, поскольку в основе любого биотехнологического производства лежит та или иная клеточная культура. Студенты должны знать, как правильно организовать работу в культуральной лаборатории, какое оборудование существует для достижения этих целей и как его правильно применять, чем руководствоваться при выборе объектов культивирования и питательных сред, какие этапы работы предшествуют собственно процессу культивирования. Только в этом случае можно рассчитывать на эффективное применение полученных знаний.

Новизна и актуальность темы заключается в сочетании различных форм работы, направленных на углубление биолого-экологических знаний с опорой на практическую деятельность и с учетом региональных экологических особенностей.

Студенты учатся самостоятельно планировать постановку эксперимента, в полевых условиях отыскивают материал и создают питательные среды для культивирования свободноживущих простейших разных систематических групп. Получив определенный результат, изучают простейших под микроскопом, фотографируют, составляют схемы проведения эксперимента и готовят отчет с презентацией.

Такая методика лабораторных работ способствует формированию творческого подхода к выполнению поставленной задачи, пытливости ума, приобретению исследовательских навыков при работе с микроскопом, дает основы систематики, используемые в биологии.

Формы отчетности по данной теме должны быть представлены в отчете по такой схеме:

1. Выявленные места обитания простейших в природе.

2. Методы взятия проб простейших разных систематических групп в естественном биоценозе.

3. Подготовка питательной среды для культивирования простейших.

4. Процесс культивирования разных систематических групп.

5. Просмотр материала под микроскопом, определение, зарисовки и фотографирование.

6. Составление блок-схемы процесса культивирования разных систематических групп простейших

7. Отчет с презентацией.

Культивирование простейших (амебы, жгутиковые, инфузории) проводится по методике акад. Ю.И. Полянского (19)

СУБСТРАТЫ ДЛЯ  КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИООБЪЕКТОВ

Принципы составления питательных сред. Все живые клетки нуждаются в экзогенных источниках питания, содержащихся  в питательных средах.

Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и развитие биообъектов.

Прежде чем начинать работы по культивированию разных типов одноклеточных необходимо точно знать их питательные потребности и зависимости. Постоянным компонентом питательных сред является вода, в которой нуждаются все живые клетки. Некоторые компоненты питательных сред, находящиеся в твердом агрегатном состоянии, могут либо образовывать придонный осадок, либо равномерно распределяться по всему объему в виде взвеси, либо плавать на поверхности раствора (частицы угля). Жидкие углеводороды при внесении в воду образуют несмешивающуюся фракцию. В питательной среде должны присутствовать все элементы, необходимые для построения компонентов живых клеток в доступной для усвоения форме. В больших количествах клеткам необходимы макроэлементы: углерод, азот, кислород, водород, фосфор, сера, калий, кальций, магний. Снабжение клеток кислородом и водородом осуществляется за счет воды. Углерод является составной частью всех органических соединений и его источники многочисленны и многообразны: чаще всего сахара, многоатомные спирты и органические кислоты. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного и растительного происхождения. Помимо макроэлементов, клетки в незначительных количествах нуждаются также и в некоторых микроэлементах: натрий, марганец, никель, кобальт, хлор, цинк, медь, кремний, молибден, бор, ванадий и некоторые другие.

Отмечается целесообразность промышленного культивирования свободноживущих простейших, в частности, инфузорий. Известны работы по созданию технологической схемы непрерывного культивирования инфузории Paramecium caudatum Ehrenberg, 1838, как «стартового» корма для рыб (Олексив, 1986), а также по массовому культивированию инфузорий в морской воде (Новоселова, 2013). Разработан аппарат для непропорционально-проточного культивирования крупных инфузорий Spirostomum ambiguum Muller, 1786 (Пролубников, Кокова, 1987), в котором определены оптимальные площадь поверхности дна для оседания инфузорий и интенсивность аэрации. Получены мутации простейших, снижающие запрет на размножение, т.е. утратившие характерные для них стадии покоя и размножающиеся непрерывно многие годы (Хлебович, 1986). Spirostomum ambiguum также широко применяется для токсикологических и фармакологических исследований (Цисанова и др.). Исследуют возможность массового культивирования хлореллы как источника ценных химических соединений (каротиноидных комплексов, аминокислот и других ценных соединений. Показано, что суспензия и сырая паста хлореллы при добавлении к рационам сельскохозяйственных животных и птиц повышают их продуктивность до 30 %. Несомненен разноплановый теоретический интерес изучения протистов.

Поэтому не случайно протисты привлекают внимание многих исследователей, а протистология достаточно интенсивно развивается.

Простейшие – это организмы, тело которых представлено одной клеткой. Они обитают в разнообразных условиях среды, и в первую очередь в водоемах богатых органическим веществом. Их легко обнаружить среди водной растительности и на дне водоема среди остатков гниющих растений. Простейшие могут давать несколько поколений всего за одни сутки, поэтому возможность получения больших их биомасс открывает перспективы практического приложения культивирования простейших.

Среди простейших наиболее широко используются инфузории, и в первую очередь инфузория туфелька (Paramaecium caudatum Ehrenberg). Размеры разных видов инфузорий невелики – 50-100 мкм, поэтому их можно увидеть только при большом увеличении микроскопа. У инфузории туфельки размер тела значительно больше, около 200 мкм. Из-за малых размеров инфузории являются доступным кормом для личинок большинства рыб (как промысловых, так и аквариумных). В связи с этим простейшие широко используются в практике лабораторного и промышленного культивирования на ранних стадиях развития рыб.

Тело инфузорий покрыто продольными рядами многочисленных

мелких ресничек, которые совершают волнообразные движения. С их помощью туфелька плавает (тупым концом вперед). Несмотря на малые размеры инфузории достаточно подвижны. Так, Paramaecium caudatum при комнатной температуре двигается со скоростью до 2,5 мм/с. То есть, за одну секунду проделывает расстояние, превышающее длину тела в 10-15 раз (в 2-3 раза быстрее, чем рекордсмен мира в беге на 100 м). Это обстоятельство следует учитывать при выкармливании мелких, малоподвижных личинок рыб, которые даже при высокой концентрации инфузорий иногда остаются голодными (не могут схватить подвижную инфузорию).

С помощью ресничек инфузории подгоняют корм, в том числе и бактерий, к ротовому отверстию. Ротовое отверстие всегда открыто. Мелкие пищевые частицы проникают через рот в глотку и скапливаются на ее дне. После чего пищевой комок вместе с небольшим количеством жидкости отрывается от глотки, образуя в цитоплазме пищеварительную вакуоль. Последняя проделывает в теле инфузории сложный путь, в процессе которого осуществляется переваривание пищи.

Питаются инфузории бактериями, водорослями, грибами, мелкими мертвыми частицами (детритом) и растворенным органическим веществом (РОВ). Чем меньше размер инфузорий, тем большую роль в их питании играют бактерии. Разные бактерии и водоросли имеют для них различную пищевую ценность. Следует учитывать, что инфузории могут отфильтровывать и заглатывать любые частицы, независимо от их питательной ценности, поэтому присутствие в среде нежелательных частиц (минеральной взвеси, «грубого» детрита) сказывается на их продуктивности.

Суточный рацион достигает 500% от массы их тела, коэффициент использования потребленной пищи на рост К₁ равен 30-40%, а коэффициент использования усвоенной пищи на рост К₂ – 50-70%. Т.е., инфузории достаточно эффективно используют потребленную пищу.

Размножение инфузорий происходит путем деления клеток. Кроме того, размножение может осуществляться половым путем. В последнем случае две клетки соединяются (конъюгируют), в результате чего происходит обмен частями ядерного аппарата, несущего наследственную информацию.

В оптимальных условиях инфузории обладают высокой интенсивностью размножения. К примеру, Stylonichia pustulata при температуре 20-25^оС делится 4-5 раз в сутки. При одинаковой температуре быстрее размножаются мелкие инфузории, число которые может за 6 суток увеличиться до 10 млн. экземпляров.

Мелкие виды морских инфузорий делятся со скоростью 3 деления в сутки, более крупные 1-2 деления. В пресных водоемах (в частности, в Можайском водохранилище) время удвоения массовых видов простейших составляет 3-40 часов, а наименьшая – у мелких представителей – 3-8 часов (Белова, Садчиков, 2005). Их численность в толще водохранилища достигает 4 тысяч экземпляров в литре воды.

Многие инфузории выдерживают значительное понижение температуры. Установлено, например, что P.caudatum при понижении температуры до 0^оС продолжает делиться, но в замедленном темпе (один раз в 20 дней). Верхний температурный порог этого вида из средней климатической зоны составляет 36^оС, но уже при 30^оС организмы находятся в угнетенном состоянии. Жизненные процессы инфузорий протекают более интенсивно при периодической смене температур, чем при постоянной. В диапазоне от 4 до 28^оС парамеция хорошо выдерживает суточные колебания температуры в пределах 12^оС.

На рост, размножение и питание инфузорий большое влияние оказывает рН среды. Оптимум для P.caudatum лежит в пределах 6,6-7,6, причем развиваются они и при больших колебаниях рН от 4,7 до 9,1. Инфузории устойчивы к пониженным концентрациям кислорода в воде. Однако оптимальные значения этого показателя для большинства видов находятся в пределах 6-8 мг/л.

Биохимический состав инфузорий (Paramecium caudatum) составляет: протеин – 58% от сухой массы, жир – 32%, зола — 3%. Калорийность – 6,6 ккал/г сухого вещества. Суточная удельная продукция составляет 4,0 и более. Т.е., за одни сутки инфузории могут увеличить биомассу в 4 раза. Это делает их перспективным кормом для личинок рыб.

В практике лабораторного и массового культивирования обычно используют высокопродуктивные и широко распространенные в эвтрофных водах виды, такие как Paramaecium caudatum, P.aurelia, P.bursaria, P.multimicronudeatum, Stylonichia (Oxytricha) pastulata, Colpoda steine, Colpidium colpoda, C.stiatum, C.campilium, Tetrahymena pyriformis.

Основными факторами, влияющими на рост и развитие инфузорий, являются: количество и качество пищи, накапливающиеся в среде продукты метаболизма, рН среды, температура, содержание кислорода и т.д.

При культивировании простейших применяют различные бактериальные, водорослевые и дрожжевые питательные среды. Наиболее часто используется сенной настой, на котором обильно развивается сенная палочка (Bacillus subtilis) и другие бактерии, служащие пищей для простейших. Исследователи в качестве корма при лабораторном культивировании Paramaecium caudatum использовали сухое молоко, смесь дрожжей и бактерий, экстракт хлореллы, овсяной отвар и др.

На темп развития простейших влияет качество и количество корма. Так, Paramaecium caudatum и P.aurelia имеют достаточно высокий темп деления (2,5 раза в сутки) при питании Bacillus subtilis, выделенных из сенного настоя. Показано, что при разнообразном бактериальном корме темп деления несколько выше, чем при использовании монокультуры.

Большое влияние на рост культуры простейших оказывают продукты их собственного метаболизма. Наблюдения за ростом простейших показали, что рост инфузорий прекращается задолго до того, как израсходованы питательные вещества, что связано с увеличением в среде продуктов метаболизма. В лабораторных экспериментах показано, наличие в среде метаболитов простейших приводит к их инцистированию или конъюгации, несмотря на наличие в среде достаточного количества пищи. В связи с этим культуральную среду необходимо постоянно обновлять.

В зависимости от концентрация водородных ионов (рН) среды одни и те же факторы оказывают положительное или отрицательное влияние на рост простейших. рН среды оказывает большое значение на рост и развитие инфузорий. В зависимости от рН среды размеры вакуолей и их количество сильно меняется. По мере развития культуры инфузорий рН среды заметно меняется,  от  4,7  до  8,0  и  выше.  Инфузории Paramaecium caudatum достаточно хорошо развиваются в пределах значений рН от 4,7 до 9,1; оптимум для них находится в пределах 6,5-7,0.

Интенсивность дыхания простейших увеличивается при повышении температуры среды. Дыхание инфузорий зависит от рН среды; оно наиболее интенсивно при рН 6,6-7,6. В щелочной среде интенсивность дыхания уменьшается; то же самое происходит и в кислой среде (до рН 3,7). Дыхание зависит от физиологического состояния организма, от количества пищи, условий среды обитания и т.д. При голодании интенсивность дыхания понижается.

Постоянный уровень концентрации кислорода в среде, поддерживаемый за счет продувания культуры воздухом, позволяет получать высокие плотности инфузорий, вплоть до 800 тыс. экз./мл. Поэтому в процессе культивирования простейших среда должна постоянно обогащаться кислородом.

При  низких  температурах  (в  пределах  0^оС) Paramaecium caudatum делится один раз в 20 суток. По мере повышения температуры среды до 28^оС темп деления заметно повышается. При температуре свыше 30^оС темп деления понижается, вплоть до его полного прекращения при 35^оС. Так, темп деления Paramaecium caudatum при 29^оС составляет 2 деления в сутки, а при комнатной температуре – одно деление. Температура оказывает влияние на размеры инфузорий, интенсивность движения, деятельность сократительной вакуоли, дыхание и т.д. Температурный оптимум для P.caudatum лежит в пределах 26-30^оС.

Резюмируя  изложенное  выше можно  отметить,  лучшим кормом для Paramaecium caudatum являются бактерии (Bacillus subtilis, Aerobacter aerogenes), а также смесь бактерий и дрожжей. Оптимальное значение рН лежит в пределах 6,8, температура среды – 28^оС. В культуре простейших могут накапливаться продукты метаболизма, которые, если их не удалять, ведут к прекращению роста или гибели парамеций. Культуре простейших необходима постоянная аэрация воздухом.

Культивирование простейших ведут в накопительном или проточном режимах. При накопительном культивировании достаточно быстро накапливаются продукты метаболизма, поэтому этот метод используется для получения одноразового небольшого количества простейших. Однако при использовании серии культиваторов (колб или иных сосудов) можно длительное время поддерживать культуру простейших.

Для периодического культивирования широко используется сенной отвар. Берут 10 г сена и помещают его в 1 л воды, кипятят в течение 20 минут, затем фильтруют и разбавляют равным количеством воды (или используют без разбавления).

В настоящее время большое внимание уделяется методам проточного культивирования. В практике непрерывного культивирования микроорганизмов применяют два метода культивирования: пропорционально-проточный и непропорционально-проточный, которые подробно описаны в книгах: В.Е.Кокова и Г.М. Лисовский (1976, 1982). Эти методы также могут использоваться при культивировании микроводорослей, коловраток и других организмов.

Непрерывное      пропорционально-проточное     культивирование характеризуется тем, что клетки и культуральная среда в выводимой из культиватора суспензии находятся в том же соотношении, что и в культиваторе. Это достигается установкой в культиваторе различных перемешивающих устройств, обеспечивающих равномерное распределение организмов в суспензии. Непрерывное непропорционально-проточное культивирование характеризуется тем, что соотношение организмов в культиваторе и в выводимой из культиватора суспензии находятся совершенно в ином соотношении. Это связано с тем, что часть клеток простейших осаждаются на стенках культиватора, особенно при использовании пластин, увеличивающих внутреннюю поверхность сосуда.

Для выращивания простейших используются сосуды типа делительных воронок с одним или двумя эрлифтами объемом от 0,2 до 10 литров. Эрлифты служат для аэрации среды, с расходом воздуха 9 л/мин. Кормом служит смесь дрожжей и бактерий. Ежедневно 3-10 раз сливают определенный объем культуры парамеций и добавляют равный объем среды с кормом. Оптимум скорости потока среды составлял 0,6 объема среды в культиваторе, т.е. 60%. Специалистами были получены высокие показатели продуктивности культуры. Суточная продукция инфузорий стабильно держалась на уровне 2 г сухого или примерно 20 г сырого вещества на 1 л культуры.

В улучшенном варианте культиваторов с двумя эрлифтами и дополнительными поверхностями (с пластинами внутри для увеличения площади прикрепления парамеций) была достигнута максимальная плотность культуры 73 тыс. особей на 1 мл. Полученные величины продукции инфузорий 20 кг/м3 в сутки намного превышают продукцию других организмов при периодическом культивировании.

Для пропорционально-проточного метода используют реакторы с перемешивающим устройством, обеспечивающим равномерное распределение организмов в среде. Для регулирования подачи среды при непрерывном методе используют специальные дозаторы, которые подают питательную суспензию в реактор и удаляет определенный объем отработанной суспензии вместе с простейшими. Ролики изготовлены из тефлона, шланги – медицинские. Дозатор прикрепляется к мотору с определенным количеством оборотов и работает в заданном режиме. Скорость потока может изменяться за счет диаметра шланга и скорости вращения роликов.

При  данном  способе  культивирования  на  10-е  сутки популяция Paramaecium caudatum достигала 14 тысяч экземпляров в 1 мл среды (при исходной численности 1 тыс. экз./мл) и удерживалась на этом уровне в течение одного месяца. Продукция составляла 6 тыс. экз./мл в сутки (или 6 г сырого вещества на 1 литр в сутки).

Для получения культуры простейших обычно используют настой сена. При приготовлении сенного настоя возможны различные варианты соотношения сена и воды, а также замачивания сена водой. При лабораторном культивировании берут 10-20 г сена на 1 л воды. При массовой культивировании инфузорий (в помещении или под открытом небом) лучшие результаты были получены при концентрации сена 1-2 г/л. При более высоких концентрациях сенного настоя культура быстро загнивает, и на поверхности воды появляется бактериальная пленка.

Сено заливают сырой водой и кипятят в течение 15-20 минут (чтобы убить нежелательные организмы), затем настаивают в течение 2-3 дней и фильтруют. При приготовлении большого количества сенного настоя (к примеру, для культивирования простейших в больших бассейнах) сено

следует залить кипятком, затем охладить его, а настой процедить. Срок настаивания 2-3 дня.

Во время кипячения погибают все микроорганизмы, но сохраняются споры бактерий. Через несколько дней из спор развиваются сенные палочки, служащие пищей для инфузорий. По мере необходимости настой добавляют в культуру простейших. Настой может храниться в холодном месте в течение одного месяца.

Кормовые дрожжи вносят из расчета 100 мг/л. Для создания бактериальных сред используют также настой из растительного салата, разбавленного молока, отвар из различных круп. Кроме того, в качестве корма для инфузорий можно использовать высушенные корки банана, дыни, нарезанную морковь, молоко, сушеные листья салата и других овощей и фруктов, которые являются субстратом для развития бактерий. Отвар сливают в чистую посуду и заражают инфузориями.

При использовании указанных выше кормов важно не передозировать питание. В противном случае размножающиеся бактерии резко снижают концентрацию кислорода в среде, что отрицательно сказывается на развитии простейших.

Инфузорий культивируют в различных емкостях – колбах, делительных воронках, аппаратах Вейса, бассейнах, полиэтиленовых садках и др. Хорошие результаты достигаются при комнатной температуре, но пик размножения инфузорий наблюдается при 22-26^оС. В первые дни культивирования продувка должна быть очень слабая, чтобы не поднимался осадок со дна сосуда. При наличии продувки инфузории располагаются в нижней части сосуда, а при недостатке кислорода они устремляются к поверхности воды. Это их свойство используют для концентрирования инфузорий перед скармливанием их личинкам рыб. Кроме того, инфузории обладают положительным фототаксисом, т.е. стремятся к свету. Это тоже позволяет их собирать в больших количествах.

«Закваску» инфузорий вносят в емкость из сенного настоя (из расчета 20 г сена на 1 л воды). Для этого достаточно внести несколько капель на 1 л воды. Живой корм необходимо начинать приготавливать за 8-9 дней до получения одно- и двухдневных личинок толстолобиков, кефалей и других рыб с малым ртом. Культуру инфузорий, используют, как правило, не дольше 20 дней, после чего ее заменяют новой. Для постоянного поддержания культуры ее заряжают в нескольких сосудах с интервалом в неделю, при этом каждый сосуд перезаряжают каждые две недели. Для длительного хранения культуры инфузорий, ее хранят в холодильнике при температуре 3-10^оС.

Инфузорий вносят в емкость, где содержатся личинки рыб при оптимальной плотности посадки 10 тысяч штук на 1 м³ воды. На рыбоводных заводах для этой цели используют детские ванны объемом 40 л. В первые два дня проточность воды необязательна. Для аэрации воды при необходимости можно применять аквариумный компрессор с распылителем воздуха.

Опыты культивирования свободноживущих инфузорий в проточном режиме, указывает на принципиальную возможность получения в небольших производственных емкостях больших количеств живого корма, доступного

личинкам всех видов рыб в первые дни выклева..