Определение энтерокиназы ( по Г.К. Шлыгину ).

Энтерокиназа - специфический кишечный фермент, вырабатываемый слизистой оболочкой тонких кишок, катализирующий превращение трипсиногена в трипсин.

Принцип. В основу метода положено активирование энтерокиназой неочищенного препарата трипсиногена. Способность воздействовать на трипсиноген в его естественном виде в присутствии ингибитора трипсина за короткое время - несколько десятков минут -является специфическим проявлением действия энтерокиназы.

Активирование проводят в стандартных условиях с использованием ряда возрастающих разведений исследуемого материала. Находят максимальное разведение материала, которое еще обусловливает определенную интенсивность действия энтерокиназы: вызывает триптическую активность, достаточную для переваривания казеина, в отличие от его створаживания.

Реактивы. 1. Препараты трипсиногена (сухой препарат поджелудочной железы коров, специально приготовленный для данной цели) выпускаются Московским мясокомбинатом, могут быть приготовлены в лаборатории. 2. Очищенный казеин готовят путем двукратного растворения в аммиаке (без нагревания) и осаждения уксусной кислотой. 3. 0,2 М фосфатный буфер (рН 7,16): смесь 3 объемных частей 0,2 М КН2РО4 и 7 частей 0,2 М Nа2НРО4. 4. 0,7 н аммиачный буфер рН 8,9: смесь 1 объемной части 0,7 н раствора аммиака (проверенного титрометрически) с 4 частями 0,7 н раствора NH4С1. Буфер можно хранить 1-2 недели. 5. 5% раствор казеина, содержащий кальций. Готовят каждый раз в день проведения определения. На одно определение энтерокиназы требуется 0,75-1 г очищенного казеина (указанного выше). На 1 г казеина берут 11 мл 1,15% раствора молочнокислого кальция и 9 мл 0,1 н раствора аммиака (проверенного титрометрически). Казеин заливают раствором молочнокислого кальция, тщательно перемешивают, добавляют аммиак и после растворения казеина раствор помещают на холод при температуре от 0 до 4°С

Оборудование. 1. Цилиндрической формы бюксы диаметром 2,5 см (несколько десятков). 2. Черные фотографические кюветы. 3. Пипетки, калиброванные на 2 мл с выдуванием. 4. Центрифуга 2500-3000 об/мин. 5. Термостат. 6. Торсионные весы. 7. Ступки.

Ход определения. Готовят водную вытяжку фекалий (1:10) путем растирания их в ступке с кварцевым песком или измельченным стеклом при постепенном добавлении воды. Спустя 30 мин. осадок отделяют центрифугированием; если вытяжка имеет кислую реакцию на лакмус, ее нейтрализуют добавлением аммиака и затем разводят водой вдвое (разведение материала 1:20). Если ожидают высокое содержание энтерокиназы, разводят еще в 10 раз (1:200), иногда даже в 100 раз (1:1000). В 7-10 бюксах готовят ряд геометрически возрастающих разведений так, что количество исследуемого материала убывает на 1/3 в каждом последующем сосуде по сравнению с предыдущим. Для этого во все бюксы, кроме первого, наливают по 1 мл дистилированной воды, в первый наливают 1 мл разведенной вытяжки. Путем двукратного набирания в пипетку и обратного выдувания вытяжку перемешивают с содержащейся во втором бюксе водой. Из второго бюкса 2 мл смеси переносят в третий, где таким же образом перемешивают, снова переносят в следующий бюкс и т. д. Из последнего бюкса 2 мл смеси отбрасывают. Во все бюксы прибавляют по 2 капли раствора фосфата рН 7,16 (реактив №3) и по 0,03 г препарата трипсиногена (реактив №1). Навески препарата по 0,03 г в нужном количестве подготовляют еще до начала определения, Удобно пользоваться для этого торсионными весами. После прибавления препарата, смеси взбалтывают и помещают для активирования в термостат на час при 37°С. После этого во все сосуды быстро прибавляют по 0,5 мл 0,7 н аммиачного буфера рН 8,9 (реактив №4) и по 2 мл 5% раствора казеина, содержащего кальций (реактив №5), взбалтывают, переставляют на нагретую в термостате подставку с темным дном и вновь инкубируют при 37°С в течение 10 мин, после чего регистрируют результат. При надлежащем предварительном разведении материала казеин в нескольких бюксах с большим содержанием энтерокиназы оказывается переваренным, а в других - створоженным, что легко различимо невооруженным глазом. Регистрируют последнюю переваренную порцию, содержание энтерокиназы в которой равно одной условно принятой единице. Отсюда простой расчет дает содержание этого фермента в I мл или I г первоначально взятого исследуемого материала: Е=Р/а, где а -количество разведенной вытяжки в последней переваренной порции; Р - предварительное разведение. Возможная ошибка таких определений равняется 1/6- 1/4 находимого количества единиц.

Клиническое значение. В фекалиях здоровых взрослых людей содержится от следов до 20 ед/г энтерокиназы. Характер (до 10 дней) пищи мало влияет на содержание фермента, только после очень резкого изменения диеты на 2-3-й день оно может быть несколько повышено -50-60 ед/г. Концентрация энтерокиназы зависит главным образом от состояния функции толстых кишок и деятельности нормальной кишечной микрофлоры. При их нарушении находят 200 ед/г и более, а при острых кишечных заболеваниях с диареей - до 2000-3000 ед/г. У детей первых 2 лет жизни в норме высокое содержание энтерокиназы в фекалиях, в возрасте около года - 700-800 ед/г.

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ КОПРОГРАММЫ

Копрологические синдромы патологических состоянии

Органов пищеварения

При нарушении функции различных отделов желудочно-кишечного тракта появляются характерные изменения кала, получившие название копрологических синдромов, которые приводятся ниже

Недостаточность жевания проявляется наличием в кале большого количества непереваренных частиц корма (зерна овса, стебли растений у травоядных; куски мяса, жира, пленки соединительной ткани у плотоядных животных).

Недостаточность желчеотделения проявляется следующими признаками: цвет кала белый, глинистый, серовато-белый, что особенно хорошо заметно у молодняка молочного возраста, при этом реакция на билирубин и стеркобилин отрицательная или слабоположительная; в кале у телят молочников в большом количестве появляются жирные кислоты; мыла и нейтральный жир обнаруживаются в небольшом количестве; количество же аммиака увеличивается примерно в два раза при нормальном содержании органических кислот; консистенция кала чаще мазевидная, его запах зловонный, реакция кислая, часто щелочная вследствие вторичных гнилостных процессов.

Недостаточность панкреатического сокоотделения характеризуется тем, что кал у телят - молочников неоформленный, чаще мазевидной консистенции; запах кала гнилостный, реакция чаще щелочная. Из жировых элементов резко увеличено количество нейтрального жира; жирные кислоты и мыла содержатся в незначительном количестве или отсутствуют. Количество аммиака в кале резко увеличено при незначительном повышении органических кислот в нем.

Недостаточность переваривания в тонком кишечнике сопровождается следующими признаками: консистенция кала у телят жидкая, его цвет желтый, запах слабогнилостный, реакция слабощелочная; в кале в большом количестве обнаруживаются нейтральный жир, жирные кислоты и мыла; количество аммиака и органических кислот в кале может быть не увеличено при диарее, но соотношение между ними изменено в сторону щелочности.

Недостаточность переваривания в толстом кишечнике проявляется следующими признаками: при преобладании процессов брожения консистенция кала кашицеобразная, часто пенистая из-за обилия пузырьков газа, цвет кала желтый, запах кислый, реакция его кислая; количество органических кислот резко увеличено и несколько уменьшено количество аммиака; реакция на растворимый белок чаще положительная; нейтральный жир в кале отсутствует или встречается в очень небольшом количестве; количество мыл и жирных кислот незначительно; много встречается переваримой клетчатки, крахмала и йодофильной флоры; при преобладании процессов гниения в кишечнике кал жидкий, темно-коричневый, гнилостного запаха, щелочной реакции; количество аммиака в нем резко повышено; реакция на растворимый белок чаще положительная; нейтральный жир обычно отсутствует; количество мыл и жирных кислот незначительно; количество переваримой клетчатки иногда значительно.

Воспаление кишечника сопровождается появлением в кале примеси слизи, крови, гноя. При микроскопическом исследовании кала обнаруживают большое количество лейкоцитов в слизи, цилиндрический эпителий, иногда пластами, в некоторых случаях находят эритроциты. Часто выявляется «скрытая» кровь, реакция Трибуле-Вишнякова всегда резко положительная (А.М.Смирнов, И.В. Никишина)

Клинический опыт показывает, что могут встречаться как изолированные формы перечисленных расстройств, так и различные их сочетания, при этом некоторые копрологические синдромы являются ведущими при постановке диагноза. Результаты исследования кала следует выражать в виде,так называемой копрограммы, по которой легче изучить патологические сдвиги органов пищеварения.

Таким образом, диагностика болезней пищеварительной системы основывается на синтезе полученных фактических данных - симптомов, полученных при общих, инструментальных и лабораторных -методах исследовании больного животного.

Список использованной литературы