Разработка критериев качества лекарственного растительного сырья ферулы заилийской

По сведениям всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) лекарственные средства растительного происхождения составляют немалую часть объема фармацевтической индустрии. Значительная часть населения развивающихся стран в рамках системы первичной медико-санитарной помощи использует традиционные препараты природного происхождения. Безусловно, на сегодняшний день растительные препараты не могут полностью заменить терапию лекарствами синтетического происхождения, но могут найти эффективное применение при лечении заболеваний. База данных препаратов природного происхождения составляет на сегодняшний день около 4000 наименований. Отсутствие четких критериев и методов оценки лекарственных растительных средств стало причиной того, что из одного вида сырья в настоящее время производят как лекарственные препараты, так и биологически активные добавки к пище. В результате нередки случаи необоснованного назначения и нерационального дозирования растительных средств. Все это вводит в заблуждение как врача, так и пациента и в конечном счете, дискредитирует сам метод фитотерапии.

Для полноценного использования растительных препаратов в медицинской практике необходимо четко осознавать тот факт, что стандартизация лекарственного растительного сырья и совершенствование методов контроля качества фитопрепаратов является важнейшим условием их эффективного применения.

Основным нормативным документом на лекарственные средства является Государственная фармакопея Республики Казахстан, в которой изложены общие статьи по стандартизации лекарственных средств и монографии по использованию отдельных видов сырья растительного происхождения. Кроме того, продолжают действовать государственные стандарты (ГОСТы), отдельные фармакопейные статьи, по различным причинам не включенные в государственные фармакопеи.

В нормативных документах фитопрепараты, как правило, рассматриваются с точки зрения основных параметров, включающих:

1. Визуальную характеристику (видовая принадлежность).

2. Качественные реакции (определение подлинности сырья).

3. Количественный анализ (определение содержания уровня биологически активных соединений) и параметры валидации используемого метода.

4. Физико-химические свойства биологически-активных соединений.

5. Обоснование способа получения субстанции и лекарственной формы.

6. Фармакологические свойства биологически активных соединений и лекарственной формы, а также соотношение химического состава лекарственного растительного сырья и фитопрепарата.

7. Возможные процессы трансформации БАС в ходе сушки, хранения, переработки лекарственного растительного сырья.

Таким образом, проведение мероприятий по стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов является важной и актуальной задачей на современном этапе развития фармацевтической науки и требует от специалистов, работающих в этой области, тщательной систематизации и более детального анализа полученных в ходе экспериментов данных для их последующего включения в соответствующие разделы разрабатываемого нормативного документа.

Нами проведена оценка качества лекарственного растительного сырья корни ферулы заилийской (Ferula transiliensis) по основным показателям в соответсвии с требованиями ГФ РК.

 

4.1.1 Описание

Описание растения. Стебли в числе нескольких, 40-70 см высотой, круглые, гладкие, как и листья, сизые и голые, вверху немного ветвящиеся. Прикорневые листья собраны по нескольку, черешковые, черешки круглые, около пластинки сочлененные, последняя в очертании широкоромбическая, многократно перисто-рассечённая на мелкие ланцетовидные или ланцетовидно-яйцевидные, толстоватые, 3-10 мм длиной, дольки, иногда надрезанные на несколько лопастей. Стеблевые листья с уменьшенной пластинкой сидят на ланцетовидных влагалищах, верхние без пластинок. Зонтики 10—18-лучевые, без обвёрток и обвёрточек, лучи неравные, до 8 см длинной, растопыренные, зонтики 10-20 цветковые. Лепестки 1мм длинной. Плоды эллиптические, сизоватые, 6-7 мм длинной, спинные ребра их нитевидные, едва выдающиеся.

Место сбора. Корни Ферулы заилийской собранные с ранней весны и до поздней осени 2020 года на горных склонах Заилийского Алатау.

 

4.1.2 Диагностические элементы

На поперечном срезе корня видна толстая слоистая пробка, в которой чередуются почти бесцветные и темноокрашенные слои. Флоэма и ксилема образуют вееровидные участки в периферической части корня и соединяются извилистыми анастомозами в центре. Во флоэме и паренхиме корня имеются многочисленные секреторные каналы. В клетках паренхимы, окружающих секреторные каналы, содержатся маслянистые включения и крахмал, в сердцевинных лучах - маслянистые включения, в прилегающих к ним клетках паренхимы - крахмал. Крахмальные зерна в основном простые, округлой, овальной или удлиненно-эллиптической формы.

 

 

Рисунок 8 - Aнaтoмичecкoe cтpoeниe кopня Ферулы заилийской нa пoпepeчнoм cpeзe. a – микpoфoтoгpaфия,. 1 – cxизoгeнныe вмecтилищa, 2 – пpoбкa, 3 – кaмбий, 4 – кopoвaя пapeнxимa, 5 – пapeнxимныe лyчи, 6 – эндoдepмa, 7 – флoэмa, 8 – кcилeмa

 

Таблица 3 - Mepныe пoкaзaтeли oтдeльныx клeтoк кopня Ферулы заилийской

 

Толщина коровой зоны, мкм	Толщина коровой паренхимы, мкм	Толщина корки, мкм	Диаметр просветов схизо-лизингенных вместилищ, мкм	Диаметр ксилемных сосудов, мкм
17,95	15,75	4,58	0,50	0,62

 

4.1.3 Качественное определение эфиров

Цельное сырье. Корни с разветвленным стеблекорнем, измельченные на куски, корни со стеблекорнем длиной 7-12 см. Толщина корней от 5 до 14 см, стеблекорни от 1,5 до 3,5 см толщиной, 2-4 см длиной. На верхушке разветвлений стеблекорня имеется пучок желтовато-серых волокон, представляющих собой остатки отмерших листьев. Цвет корня и стеблекорня снаружи серовато-коричневый, в изломе – желтовато - или серовато-белый; характер излома сильно волокнистый.

Измельченное сырье. Кусочки корней различной формы, желтовато-серого или серовато-белого цвета, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 8 мм. Запах хвойный. Вкус горьковатый.

Показатель общей золы определяли по ГФ РК; золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты по ГФ XI; другие части растения (листья, черешки, в том числе отделенные при анализе) по ГФ РК; минеральные примеси по ГФ РК.

При разработке методики количественного определения суммы сложных эфиров изучали условия экстракции в зависимости от степени измельченности сырья и концентрации спирта (табл. 1).

Из таблицы 1 видно, что при экстракции суммы сложных эфиров частицы сырья должны быть размером 2–6 мм и концентрация спирта 95%.

Получение экстракта для анализа: Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 2,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в фильтровальную бумагу, опускали в экстрактор аппарата Сокслета, рабочий объем которого около 200 мл, заливали 180 мл 95% спирта и экстрагировали в течение 2,5 ч (6 сливов) на кипящей водяной бане. Спиртовое извлечение концентрировали на роторном испарителе до объема 15 мл, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили объем раствора тем же спиртом до метки и тщательно перемешивали.

Методика качественного определения сложных эфиров в корнях ферулы заилийской:1 мл спиртового экстракта, полученного вышеуказанным методом, помещали в пробирку, приливали 0,1 мл раствора ванилина в серной кислоте, в результате наблюдалось сине-зеленое окрашивание, характерное для сесквитерпенов.

 

 

Рисунок 9. Сине-зеленое окрашивание

 

Таблица 4. Влияние условий экстракции на выход сложных эфиров

 

Условия экстракции	Выход сложных эфиров к массе сырья, %
Размер частиц сырья, мм до 2 2-4 4-6 6-8	6,15 6,23 6,24 6,11
Растворитель этиловый спирт, % 95 90 80 70	6,19 5,92 5,61 5,26

 

Методом анализа в тонком слое с использованием пластинки «Силуфол УФ-254» размером 15×15 см в системе хлороформ – этанол (96%) (9,5: 0,5) установили, что основным компонентом суммы сложных эфиров является ферутинин. Для проведения анализа микропипеткой наносили 0,01 мл извлечения, полученного согласно вышеуказанному методу. В качестве свидетеля наносили 0,01 мл раствора рабочего стандартного образца ферулена в 96% этаноле (50 мкг). Пластинку высушивали на воздухе до удаления запаха растворителей; затем помещали в камеру со смесью растворителей: хлороформ – этанол (96%) (9,5: 0,5) и хроматографировали восходящим способом (без насыщения). Когда фронт растворителей прошел около 12 см, пластинку вынимали из камеры, подсушивали на воздухе до исчезновения запаха растворителей и просматривали в УФ-свете. На хроматограмме наблюдались пять пятен, из них два основных: с Rf около 0,5 (ферутинин) и Rf около 0,4 (тенуферидин) на уровне пятен свидетеля, которые при опрыскивании раствором ванилина в серной кислоте дают характерное окрашивание: зеленое, переходящее в синее (ферутинин) и розовато-фиолетовое (тенуферидин).

 

 

Рисунок 10 - ТСХ

 

Выявлено, что при экстракции суммы сложных эфиров частицы сырья должны быть размером 2–6 мм и концентрация спирта 95%.

 

4.1.4 Качественное определение сапонинов

Для проведения качественных реакций готовили водное извлечение в соотношении 1:10 и проводили следующие реакции: реакция пенообразования, реакция Лафола, с раствором свинца ацетата и др. [32].

Для подтверждения результатов качественных реакций дальнейшую идентификацию сапонинов осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Sorbfil» в различных системахрастворителей: гексан – этилацетат (2: 1), хлороформ – этилацетат (9: 1), петролейный эфир – хлороформ – кислота уксусная (10: 4: 0,4), бензол –ацетон (3: 1). Извлечение БАС из сырья проводили с использованием в качестве экстрагента 70% этилового спирта. Далее осуществили гидролиз для определения агликонов сапонинов: из полученного извлечения отбирали аликвоту объемом 10 мл и выпаривали досуха. Остаток растворяли в 10 мл смеси: кислота уксусная ледяная – кислота хлористоводородная – вода очищенная (3,5: 1: 5,5), помещали в круглодонную колбу и нагревали на водяной бане в течение 2 ч. Затем гидролизную смесь разбавляли водой очищенной в соотношении 1: 2, выпавший осадок отделяли фильтрованием. Осадок на фильтре промывали водой очищенной, растворяли в 25 мл 95% спирта этилового. В качестве свидетеля использовали СО кислоты олеаноловой («SIGMA Aldrich», США).

После хроматографирования влажные пластинки обработали 20% раствором серной кислоты, высушивали в сушильном шкафу в течение 8–10 мин при температуре 110 °С. Зоны адсорбции веществ тритерпеновой природы и СО должны иметь окраску розово-вишневого цвета, переходящую в голубой [34, 44].

Определение содержания суммы тритерпеновых сапонинов проводили спектрофотометрическим методом после реакции взаимодействия с концентрированной серной кислотой. Тритерпеноиды протонируются по двойной связи с образованием карбокатиона, а при наличии карбоксильной группы при С-28 имеет место последующая лактонизация. При этом наблюдается характерный максимум поглощения при 310 нм [44].

Для проведения СФМ готовили извлечение следующим образом: около 2,0 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу вместимостью 250 мл, пятикратно экстрагировали 70% этиловым спиртом порциями по 50 мл на кипящей водяной бане в круглодонной колбе на 200 мл с обратным холодильником. Полученные извлечения фильтровали и объединяли в мерную колбу на 250 мл, недостающий объем восполняли экстрагентом (раствор А). Далее из полученного извлечения отбирали аликвоту объемом 10 мл и выпаривали досуха. Гидролиз проводили по методике, описанной выше. Осадок на фильтре промывали очищенной водой, растворяли в 25 мл 95% спирта этилового и собирали в мерную колбу на 25 мл (раствор Б).

К 1 мл полученного раствора Б прибавляли 4 мл очищенной серной кислоты, выдерживали 10 мин и определяли оптическую плотность на спектрофотометре VARIAN CARY – 50 в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм в области 220–450 нм. Раствор сравнения – концентрированная серная кислота. Параллельно снимали оптическую плотность стандартного раствора кислоты олеаноловой. Приготовление стандартного раствора кислоты олеаноловой: 0,004 г кислоты олеаноловой растворяли в 10 мл 95% этилового спирта. Полученные результаты обрабатывали с использованием параметрического критерия Стьюдента согласно ГФ РК [75].

 

Качественные реакции на сапонины дали положительные результаты на наличие тритерпеноидных сапонинов в корнях ферулы заилийской.

Результаты качественных реакций подтверждены методом ТСХ в системе бензол – ацетон (3:1). После хроматографирования спиртового извлечения появилось 4 пятна голубовато-фиолетового цвета со значениями Rf: 0,58; 0,66; 0,75; 0,83. Извлечение после гидролиза имело одно пятно, совпадающее по окраске (розово-вишневое, переходящее в голубой), и значению Rf (0,5) со стандартом олеаноловой кислоты.

Далее проводили спектрофотометрию. Тритерпеновые сапонины идентифицировали по характерному максимуму при 310 нм. Полученные спектры сапонинов и стандарта олеаноловой кислоты после их реакции с концентрированной серной кислотой представлены на рисунке. Количественное содержание суммы сапонинов рассчитывали по закону Бугера-Ламберта-Бера в пересчете на олеаноловую кислоту.

 

Таблица 5. Результаты качественных реакций сапонинов в корнях ферулы заилийской

 

№ п/п	Реакция	Извлечение / результат
1     2 3 4 5	Реакция пенообразования с растворами гидроксида натрия и хлористо- водородной кислотой Реакция с раствором свинца ацетата 10% Реакция Лафона Реакция с раствором нитрита натрия 10% Реакция со спиртовым раствором холестерина 1%	Образуется пена, равная по объему и Стойкости Творожистый осадок Коричнево-зеленый осадок Окрашивания не наблюдалось Бежевый осадок

 

Таблица 6. Результаты идентификации сапонинов в корнях ферулы заилийской методом ТСХ в системе бензол – ацетон (3: 1) до и после гидролиза

 

Значение Rf	Спиртовое извлечение	Спиртовое извлечение после гидролиза	Кислота олеаноловая
0,83 ± 0,01   0,75 ± 0,01   0,66 ± 0,01   0,58 ± 0,01   0,50 ± 0,01	Голубовато-фиолетовый Голубовато-фиолетовый Голубовато-фиолетовый Голубовато-фиолетовый -	–   –   –   –   Розово-вишневый, переходящийв голубой	–   –   –   – Розово-вишневый, переходящий в голубой

 

 

 

 

Рисунок 11 - Спектры поглощения сапонинов и олеаноловой кислоты в корнях ферулы заилийской: 1 – сапонины после гидролиза; 2 – олеаноловая кислота

 

Таблица 7. Результаты определения суммы сапонинов в корнях ферулы заилийской в пересчете на олеаноловую кислоту

 

Содержание сапонинов, %	Метрологические характеристики (n = 5, Р = 95%, tр = 2,78)
	SХ-	E, %
4,27 ±0,13	0,0586	2,23

 

В результате проведения количественного определения содержания суммы сапонинов в корнях ферулы заилийкой, установлено, что в пересчете на олеаноловую кислоту оно составило 4,27–5,33%.

 

4.1.5 Посторонние примеси

Взвешивали 100 г сырья, разложили тонким слоем. Исследование проводили путем визуального осмотра с помощью лупы (6х). Посторонние примеси отделяли, взвешивали и рассчитывали содержание в процентах.

В результате процентное содержание посторонних примесей составило 10%.

 

4.1.6 Потеря в массе при высушивании

В первой навеске

Масса до высушивания 5,01 г, после высушивания 4,42 г, следовательно, влажность составила 11,77 %.

Во второй навеске

Масса до высушивания 5 г, после высушивания 4,4 г, следовательно, влажность составила 12 %.

 

4.1.7 Общая зола

Масса сырья 3,105 г, масса золы 0,304 г, следовательно, содержание общей золы составило 9,790%.

 

4.1.8 Микробиологическая чистота

Результаты изучения микробиологической чистоты сырья представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Определение микробиологической чистоты сырья ферулы заилийской

 

Наименования показателей	Обозначение НД на методы испытания	Требования НД	Полученные результаты
Общее число жизнеспособных аэробных микроорганизмов, КОЕ/г	ГФ РК, т 1, стр.176	Не более 10^7	5.4x10^2
Грибы, КОЕ/г	ГФ РК, т 1, стр.176	Не более 10^5	x10^2
E.coli в 1.0 г	ГФ РК, т 1, стр.181 Не более 105	Не более 10^2	Менее 10