Понятие о липосомах, характеристика.

 

Одно из требований  предъявляемых к лекарственным формам нового поколения (ЛФНП) - это достижение их направленности - т.е.способность лекарственной формы (ЛФ) доставлять лекарственные вещества (ЛВ) к нужным органам, тканям, клеткам. Это позволяет в значительной степени повысить терапевтическую эффективность лекарств, уменьшить побочные действия, обеспечить в нужных местах высокой концентрации действующих веществ и экономичность терапии. Это особенно актуально для лечения различных тяжелых заболеваний, локализующихся на первоначальном этапе в определенных органах и системах (инфаркт миокарда,раковые заболевания, инфекционные и тд.)

Однако химиотерапевтические средства, необходимые для лечения их, к сожалению, рассеиваются по всему организму, и при этом не всегда достигается необходимая терапевтическая концентрация в нужных органах, пораженных заболеванием, а также проявляются побочные действия этих веществ на другие органы и системы (например выраженная кардиотоксичность многих цитостатиков).

Это приводит к тому, что приходится отказываться от эффективных препаратов, которые хорошо лечат болезнь или снижать их дозу и применять менее эффективные. Поэтому проблема создания высокой концентрации ЛВ в пораженных органах, не затрагивая остальные части организма очень сложная проблема, которая решается путём изыскания различных носителей. Поэтому вопросы изучения и внедрения в фармацевтическую практику разнообразных носителей лекарств очень актуальны.

- Ранее были рассмотрены микрокапсулы как носители лекарств 1 поколения.

В данной лекции - цель рассмотреть перспективы использования липосом как носителей лекарственных веществ в организме. Многочисленные исследования показали перспективность использования липосом как транспортеров лекарств.

Ранее было сказано, что липосомы (Л) - относится к носителям лекарств 2-го поколения т.к. избирательно доставляют вещества к тканям.

В настоящее время использование липосом является перспективным направлением позволяющим достичь высокой степени избирательности.

 

       Характеристика липосом их свойства.

Рассмотрим что такое липосомы. Липосомы - это искусственно получаемые сферические частицы образованные биомолекулярными липидными слоями в пространстве между которыми находится среда формирования. Слово липосома - состоит из "липо" - жир,"сома" - тело.

Чтобы оценить эффективность липосомы как переносчиков ЛВ в организме - хочу дать краткую историческую справку. В начале 6О х годах ведущий исследователь Кембриджского института физиологии животных А.Бангем, проводя свои исследования с клетками и тканями открыл интересное и важное явление: выделяя из животных тканей очищенные фосфолипиды он обратил внимание на то,что липиды при взбалтывании их суспензии способны самопроизвольно образовывать мелкие шаровидные частицы, мицеллы. Образованные мицеллы (сферические частицы) были им названы липосомами и в своих экспериментах он использовал их как модель клеточной мембраны.

Чем же обусловлено это свойство липидов самопроизвольно образовывать такие сферические образования т.е. липосомы.

Липиды, образующие оболочку липосом, представляют собой нерастворимые в воде вещества, близкие по своим свойствам к жирам. Они являются составным компонентом клеточных мембран (до 8О %).

Липиды обладают дифильными свойствами, т.е. включают в себя как гидрофильные так и гидрофобные группы. При взбалтывании в воде полярные липиды самопроизвольно образуют мицеллы (микроскопические капельки) в которых углеводородные хвосты (гидрофобные части) липидов упрятаны во внутрь, а гидрофильные головки обращены наружу, взаимодействуя с водным окружением. Если концентрация липидов в воде высока, то мицеллы слипаются и возникает плоский бимолекулярный слой (бислой). Наслаивая бислой друг на друга,можно получить многослойные липидные структуры. В зависимости от природы содержащихся в них жирных кислот фосфолипидные бислои имеют толщину от 6 до 7 нм.

Бислои липидов легко получить энергично встряхивая водные суспензии фосфолипидов. При этом также образуются липосомы- замкнутые пузырьки воды,окруженные непрерывным липидным бислоем.

Т.о, дифильность липидов является основным фактором, обуславливающим их свойство самопроизвольно, будучи выделенными из клеточных мембран, при взбалтывании их образовывать замкнутые пузырьки. Липосомы могут иметь один бислой и при этом толщина оболочки находится в пределах 6-7 -100нм,их называют униламелярными. Если же при формировании липосом образуются несколько бислоёв, то размеры их находятся в пределах 2- 10 мкм и их называют мультиламелярными.

Наблюдая эти процессы под электронним микроскопом А.Бангем в своих исследованиях использовал липосомы как модель клеточной мембраны. В результате своих научных наблюдений он выявил ряд свойств липосом, которые оказались ценными в дальнейшем при создании липосомальных лекарственных форм.

Для того чтобы понять на чем основана эффективность липосом как носителей лекарств, рассмотрим что происходит при их взаимодействии с клетками в зависимости от липидного состава оболочки:

1. Липосомы просто адсорбируются на клеточной поверхности;

2. Связавщись с клетками, липосомы "заглатываются" или (эндоцитируются). Внедрившись в клетки липосомы разрушаются ферментами клеток;

3. Липосомы просто сливаются с мембраной клеток. В этом случае мембрана липосом становиться частью клеточной мембраны;

4. Липосомы обмениваются своими липидами с клеточной мембраной;

После того как были опубликованы результаты исследований биологов о свойствах липосом, они привлекли внимание тех исследователей которые занимались изучением возможности направленного транспорта ЛВ в организме.В 1971 английский исследователь, сотрудник центра клинических исследований (г Херроу) Грегори Грегориадис впервые предложил и начал изучать липосомы с целью доставки ЛВ в организме.

Как носители ЛВ в организме липосомам присущи целый ряд важных качеств:

1. сродство, по составу, с природными клеточными мембранами (липиды составляют от 20-до 80%массы клеток);

2. это их качество, при правильном подборе компонентов, обуславливает их нетоксичность и не иммуногенность, т.е. их введение в организм не вызывает негативных явлений;

3. Универсальность, т.е. благодаря их полусинтетической природе можно широко варьировать их размеры, характеристики, состав поверхности. Это позволяет включать в липосомы широкий круг лекарственных веществ;

4. Липосомы легко разрушаются в организме, высвобождая доставленные вещества, надежно укрытые в пути, что обуславливает отсутствие побочных реакций.

5. Эффективность их связана также с характером взаимодействия с поверхностью клеток. (4-механизма).

Большое значения для взаимодействия липосом с клеточной поверхностью имеет "материал" из которого они сделаны. Если фосфолипиды, выделены из каких либо определенных клеток, то способность липосом соединяться именно с этими клетками значительно возрастает.

Например, введенные внутривенно липосомы распределяются в основном в печени, селезенки, костном мозге, в очаге воспаления и инфекции, в месте локализации раковых клеток.

Время элиминации липосом зависит от их размера. Липосомы малых размеров имеет более длительный период элиминации.Кроме того, время пребывания липосом в организме зависит от состава липидной мембраны: чем больше для липидов, тем более длительное пребывание их в организме. Высвобождение действующих веществ из липосом происходит путем диффузии через фосфолипидную оболочку, путем адсорбции с поверхности или путем деградации их.

Очень важным преимушеством липосом является то,что они,в зависимости от состава липидной оболочки, способы избирательно взаимодействовать с определенными тканями. При этом липосомы преимущественно собираются около тех тканей, липидный состав которых близок по строению к липидом оболочки липосом.

Какой из этих видов взаимодействий преобладает, зависит от многих факторов, в этом числе,от агрегатного состояния липосом. Если липосомы "твердые", они, главным образом, адсорбируются, если "жидкие" то преимущественно происходит слияние и обмен липидами.

В зависимости от размеров, физико-химических свойств и липидного состава варьируют фармакокинетические параметры лиипосом: скорость всасывания ЛВ с места инъекций, а также из плазмы крови, доставка к органам-мишеням, распределение в органах и тканях.

На следующих примерах можно раскрыть сущность избирательности действия липосом:

1. При создании липосомальной лек.формы строфантидина в качестве оболочки использовали кардиолипин- д специфический липид сердечной мышцы (компонент мембран митохондрий сердечной мыщцы). Цель создания таких липосом- добиться направленного транспорта строфантидина к сердечной мыщце, т.к. липосомы, сформированные из кардиолипина, избирательно достигают ее в силу сродства их с липидами сердечной мыщцы.

2. Создана липосомальная форма пирацина. При этом в качестве оболочки липосом использовали фосфогликолипиды, которые близки по строению к фосфолипидам поджелудочной железы и поэтому достигается направленный транспорт этих липосом к этому органу, где обеспечивается высокая концентрация препарата.В опытах in vivo на крысых было доказано, что концентрация пирацина, при введении их в виде липосом, была в 2 раза выше в области поджелудочной железы. Кроме того использование липосомального пирацина ускоряло его всасывание через кожу.

Выявленные специфические свойства липосом оказались очень ценными при их использовании в области экспериментальной онкологии. Именно в этой области впервые были успешно применены липосомы для направленного транспорта химиотерапевтических средств.Это позволило повысить дозы этих веществ и уменьшить их побочные действия (т.к. достигается направленность действия липосомальных лек.форм цитостатических препаратов в силу чего уменьшаются их побочные эффекты.)

Например, были проведены исследования (А.Габизоном, Израиль) по изучению эффективности противоопухолевого препарата адриамицина (на мышах), заключенного в липосомы.Сам адриамицин в высоких дозах весьма токсичен (в первую очередь для сердечной мышцы). При введении в/в адриамицина в липосомальной форме концентрация его в печени и селезенки, где находились опухолевые клетки, примерно в 10 раз превосходили уровень концентрации этого препарата, введенного без липосом. При этом уровень адриамицина был значительно ниже в сердечной мыщце. Отмечалось значительное торможение роста метастазов в печени по сравнению с введением контрольного чистого адриамицина. Аналогичные исследования были проведены и с другими онкологическими препаратами.

Акларубицин антибиотик активен при остром лейкозе лимфосаркоме, однако у него выраженный побочный эффект-кардиотоксичность. Создана липосомальная инъекционная форма этого препарата с целью уменьшения дозы и снижения токсичности. При сравнении с обычной формой акларубицина (липоф.высушенный порошок по 20мг во флаконах) в опытах in vivo на опухолевых клетках мышей отмечено значительное снижение токсичности препарата при введении его виде липосом.

Выше указанные примеры свидетельствуют о возможности повышения эффективности фармакотерапии если вводить ЛВ в виде липосом.

В осном это связано с их способностью адсорбироваться на поверхности тканей, клеток.

Однако способность липосом проникать внутрь клеток также открывает широкие возможности в повышении эффективности лечения многих тяжелях заболеваний, в т.ч. вирусных, паразитарных. Использование липосом для доставки лекарств внутриклеточно - важный скачок в обеспечении эффективности фармакотерапии.

Внутриклеточное расположение микроорганизмов известное и описанное явление, которое вносит изменения в фармакологическое действие лекарств. В механизме ослабления действия лекарств особое значение имеет фактор их ограниченного проникновения через оболочку (клеточную стенку). В большинстве случаев решающей является именно степень проникновения препаратов во внутриклеточную среду к месту локализации возбудителя.

Многие ЛВ не способны проникать через клеточную мембрану или ограниченно проникают, что снижает эффективность лечения. В настоящее время известно, что липосомы захватываются клетками, способными к фагоцитозу - макрофагами, лимфоцитами и т.п и, следовательно, могут использоваться для транспорта ЛВ, которые пассивно не проникают через цитоплазматическую мембрану. Это имеет очень большое значение, т.к. во многих случаях микроорганизмы - возбудители болезней (бруцеллез, малярия, спид, гепатит и т.д.) прячутся внутри клетки, защищаясь от имунной системы, а также от действия лекарств. Болезнь приобретает хроническое течение. В таких случаях липосомы, благодаря их выраженной способности проникать внутрь клеток и вводить туда свое содержимое, могут помочь в лечении инфекционных заболеваний, т.к.способствуют проникновенно ЛВ через клеточные мембраны, которая является для некоторых из них непреодолимым препятствием.

Учитывая эти свойства липосом, в настоящее время созданы липосомальные формы целого ряда ЛВ: антибиотиков, сульфаниламидов, противораковых препаратов. Например, для гентамицина, пенциллина, канамицина, стрептомицина разработаны липосомальные формы.

Эффективность липосом доказана при лечении паразитарных заболеваний (лейшманиоз) на мышах. Препарат солюсурьмин в липосомах оказался в 200 раз эффективнее обычного. Также и противомалярийные препараты в липосомах оказались более эффективными.

Ампициллин в липосомах оказался в 90 раз эффективнее обычного. Отмечено увеличении активности хлорамфеникола в липосомах. Если обычной препарат клафоран неспособен проникать в лейкоциты человека и в силу этого не эффективен при внутриклеточном инфицировании, то липосомальный пр-т накапливается в лейкоцитах и лимфоузлах и эффективно уничтожает бактерии при минимальных концентрациях - 1-10мкг/мл.

Т.о., использование липосом дает возможность повысить эффективность лечения, т.к. есть возможность уменьшить дозы, уменьшить аллергические и имунные реакции.

Очень перспективным направлением является изпользование липосом для трансдермального переноса ЛВ. Многочисленными исследованиями показана способность липосом ускорять проникновение веществ через кожу. Так, при лечении различных аллергических заболеваний кожи рациональным оказалось использованние кортикостероидов, антибиотиков, сульфаниламидов в виде липосом. При нанесении крема или мази с этими липосомами достигалась эффективность лечения, т.к. всасывание липосомальных препаратов через кожу повышалась в 5-10 раз.

Особенно переспективы липосомы при лечении сахарного диабета. Введение инсулина, пока только в виде п/к инъекций, со временем приводит к тяжелым осложнениям. Пероральный прием неприемлем - разрушения в ЖКТ. Поэтому создание пероральной формы инсулина является актуальным.Уже созданы в ряде институтов (Харьков и институт биохимии Руз) липосомальные формы инсулина, которые проходят клинические исследования.

Так, в институте биохимии АНРУз получены липосомы сахароснижающего действия на основе сульфатидов и цереброзидов (компонентов цитоплазматических мембран) и доказана их эффективность при лечении сахарного диабета. Созданы липосомы на основе лецитин- холестерина (7:1) с инсулином. Кроме того, включение инсулина в липосомы дает возможность пролонгировать действие. С каждам годом номенклатура липосомальных препаратов растет.

Фирма "Реем" (ФРГ) стала выпускать липосомальный препарат для борьбы с расширением вен. Итальянская фирма "Фидия" выпустила лекарственный препарат "липосом-форте" для стимуляции гипофиза (вводится в/в). Фирма "Виторган" (ФРГ) выпустила липосомальный гомеопатический препарат найпарадент для лечения пародонтоза, В США одна из фирм уже проводит клинические испытания препарата Амфотерицина В в липосомах для лечения лейшманиоза и грибковых заболеваний, разработаны липосомальные бронхолитические препараты. Также работают над созданием других липосомальных лек.пр-тов.Один из них липотраст, представляющий собой вераграфин, заключённый в липосомы (применяемый в рентгенодиагностике), уже проходит клинические испытания, препарат липин, предназначенный для снижения уровня продуктов окисления в тканях внутренних органов и в крови. В нашей республике в Институте биохимии ведутся разработки по созданию липосомальной формы вакцины гриппа.

Еще одна перспективная область применения липосом - это косметология. Созданы многочисленные косметические средства на основе липосом.

Одной из первых, в 1986 г, выпустила такой препарат французская фирма "Кристиан Диор" под названием "Каптюр". "Каптюр" представляет собой желе (мазь), содержащую множество липосом, в которых находится экстракт тимуса (железы внутренной секреции) и пептиты (коллаген и эластин). Липосомы с активными веществами при нанесении мази на кожу попадают в поры и затем проникают в клетки, точнее сливаются с клеточной оболочкой и добаляют ей активные вещества и одновременно увлажняют саму оболочку, тем самым замедляют старение кожи. Поэтому крем применяется для омоложения кожи лица.

В России получен крем-гель “Геликс”, содержащий липосомы для омоложения кожи лица.       

Пути получения липосом

В спомогательные вещества

Для формирования липосом используют различные фосфолипиды, полученные из растительных или животных клеток. Например яичный или соевый лецитин, холестерин, другие специфические фосфолипиды: кардиолипин, сульфатиды и т.д. Кроме того, применяются синтетические вещества N-пальмитилсерин, N-пальмитинглицин, фосфатидилхолин. Например, для получения липосом адриамицина была использована смесь фосфатидилхолина, холестерина и сульфатида в соотношении 5:4:1

 

Технология

До недавнего времени существовало около 20 способов приготовления липосом. Выбор метода зависит от цели, которая при этом преследуется. Наиболее современным и оптимальным является метод, предложенный в 80-х годах в США - метод, в основе которого лежит замораживание липосом с включенными в них ЛВ (иногда многократное с последующим оттаиванием) и последующей сушкой в присутствии различных криопротекторов (веществ, предохраняющих липосомы от разрушения при замораживании, размораживании и сушке). Для этого обычно используют различные сахара (трехалоза, маннит, сахароза, глюкоза).Этот метод - метод Бангема. Преимущество этого метода в том, что он позволяет готовить липосомы без органических растворителей и без использования ультразвука (что неблагоприятно отражается на их качестве). Так были получены липосомы с инсулином-J-125. Для этого использовали яичный лецитин и холестерин (7:1). Получали липосомы методом Бангема. Для этого сначала готовили стандартный раствор фосфолипидов (лецитин+холестерин) в четырехлористом углероде и с помощью роторного выпарителя освобождались от растворителя. К хорошо высушенной смеси добавляли буферный раствор ЛВ, перемешивали (мешалкой) в течение 10минут. После этого систему замораживали в жидком азоте (-193 С). Замороженный раствор помещали в камеру сублимационной сушилки и при вакууме (криопротектор 1% сахароза, 1% крахмал) высушивали. После чего очищали липосомы от невключенного в них инсулина путем центрифугирования при 10 тыс.об/мин.

Получение липосом со строфантидином ацетатом. В качестве липидной оболочки были использованы лецитин и кардиолипин специфический липид сердечной мышцы для обеспечения направленного транспорта препарата в область сердечной мышцы. Липосомы получали методом Бангема. Для этого сначала готовили растворы липидов (лецитин+кардиолипин). При этом сначала получали 10% раствор лецитина и 0,5% раствор кардиолипина в спирте. Затем сгушали эти растворы с помошью роторного выпарителя и добавляли раствор строфантидина ацетата. Перемешивали с помощью магнитной мешалки и подвергали воздействию ультразвука в течение 10 мин.