Методика приготування фіксованих препаратів пліснявих грибів.

Поживне середовище для культивування пліснявих грибів (СА чи ГКА) розлити в стерильні чашки Петрі по 6 - 8 см3 для одержання шару не більше 2 мм.

Застигле середовище розрізати в чашці Петрі стерильним скальпелем в асептичних умовах на сектори, що дорівнюють за розмірами формі покривного скельця. Потім на стерильне предметне скло асептично перенести скальпелем (стерильним) один сектор поживного середовища й з розмістити в центрі предметного скла. Препарувальною голкою зробити посів досліджуваної культури пліснявого гриба: профламбувати голку, опустити кінець голки в міцелій і зробити два посіви (посів уколом) у протилежних кутах агарового сектора, відступивши по 1 мм від країв сектора (рис. 5). Засіяний агаровий сектор асептично закрити покривним склом.

На дно стерильної чашки Петрі помістити невеликий шар вати, змочений водою, на який покласти предметне скло з препаратом; закрити кришку чашки Петрі й поставити в термостат при 24 °С на 72 – 120 год.

Після термостатування по краях покривного скла спостерігається ріст пліснявого гриба. Розплавити парафін і пензлем нанести на поверхню препарату й довкола нього (один або два шари). Після висихання мікроскопувати з об'єктивом 40х.

Рис. 5. Препарат пліснявого гриба на тонкій агаровій пластинці на предметному склі:

1 – предметне скло; 2 – покривне скло; 3 – середовище; 4 – посів грибів уколом

Зовнішній огляд і результати мікроскопування дають достатні підстави для того, щоб за допомогою короткого навчального визначника вивчити методику й особливості діагностики фітопатогенних уражень деяких плодів і овочів.

 

Короткий навчальний визначник хвороб плодів і овочів

Картопля

На поверхні бульби сухі плями:

а) плями нерівні, сірі, втиснені з поглибленнями; уражена тканина на розрізі бура, тверда, поширюється від поверхні в глибину "язиками". Фітофтора (Phytophtora infestans) – рис.6;

б) плями сухі, втиснені, зі складчастістю; на поверхні світлі подушечки із спороносіння гриба (білі, темні, рожеві); спори серповидні з 1–5 перегородками. Фузаріозна суха гнилизна (Fusarium solani) – рис. 7;

в) плями спочатку малопомітні світло-коричневі в основному біля вічок. Руйнується тільки верхній шар, набуваючи сріблястого кольору. Захворювання проявляється в лютому – березні (Helminthosporium solani) – рис. 8;

На поверхні бульби мокрі плями:

а) плями круглі, великі, окремі або зливаються; тканини, що розклалися, бурі, при натисканні виділяється бурувата рідина; у сухих умовах тканина зсихається, у тканинах хламідоспори гриба. Мокра грибна гнилизна (Fusarium оxysporum) – рис. 9;

б) плями мокрі, охоплюють всі тканини бульби, мають вигляд кашкоподібної маси з неприємним запахом; на межі хворої й здорової тканини – темна облямівка. Мокра бактеріальна гнилизна (Pseudomonas xanthochlora);

в) уражена тканина розріджується й перетворюється на сіру кашкоподібну масу (Erwinia carotovora) рис. 17.

 

 

              а                     б                               в                     г

Рис. 6. Phytophtora infestans (а-мікрофотографія, б-розріз ураженої картоплини, в і г - уражені відповідно томати та баклажани)

 

                   

                       а                                                                    б

       Рис. 6. Fusarium solani (а-мікрофотографія, б-уражена картопля)

 

                

                       а                                                                    б

Рис. 8. Helminthosporium solani (а-мікрофотографія, б-уражена картоплина, вигляд зовні)

 

              

                       а                                                                    б

       Рис. 9. Fusarium оxysporum (а-мікрофотографія, б-розріз ураженої картоплини)

На поверхні бульби струпи:

а) струпи плоскі, опуклі або ввігнуті, спочатку жовтуваті, потім – темно-коричневі. Звичайна парша (Streptomyces scabiens) – рис. 10;

б) на шкірці білі або чорні горбки у вигляді шматочків ґрунту, легко зішкрібуються й складаються з міцелію гриба. Чорна парша (Rhizoctonia solani) без конідій – рис. 11.

Поверхня бульби не ушкоджена, але відзначається кільцевий прояв:

 а) на розрізі бульби, у кільці судинних пучків – переривчасте або суцільне, широке, сухе руйнування бурого кольру; спори серпоподібно вигнуті з 3 – 4 перегородками. Грибна кільцева гнилизна (Fusarium oxysporum) – рис. 9;

б) на розрізі бульби судинні пучки розм'якшені, у них міститься жовтувато-білуватого кольору рідина, що при натисненні виступає краплями. Бактеріальна кільцева гнилизна (Corynebacterium sepedonicum).

 

          

                       а                                                           б

Puc. 10. Streptomyces scabiens (а-мікрофотографія, б-розріз ураженої картоплини)

 

       

                       а                               б                                        в

Puc. 11. Rhizoctonia solani (а-мікрофотографія, б-уражена капустина, в- уражена картоплина, зовні)

Морква

 Суха гнилизна:

а) на поверхні коренеплоду видно сірі, втиснені плями, тканина під ними бура, суха, порохнява, часто з порожнечами, які вистелені білим нальотом міцелію; наприкінці зберігання утворюються темні плями. Фомоз (Phoma rostrup) – рис. 12;

б) плями темні втиснені, з нальотом; захворювання проявляється у верхній і боковій частинах коренеплоду; уражена тканина чорна, відділена від здорової; у нальоті темнозабарвлені конідії з поперечними й поздовжніми перегородками. Чорна суха гнилизна (Alternaria radacina) – рис. 13.

 

      

                       а                                                  б                

Puc. 12. Phoma rostrup (а-мікрофотографія ураженої тканини, б-уражена морквина, зовнішній вигляд)

 

                       а                                                  б                в

Puc. 13. Alternaria radacina (а-мікрофотографія, б-уражені коренеплоди моркви, в-уражений апельсин, зовнішній вигляд)

 

Гнилизна мокра з нальотом:

а) наліт білий, пластівчастий з міцелію гриба (без спороносіння); великі білі або чорні склероції, м'якоть мокра без зміни забарвлення. Біла гнилизна (Sclerotinia sclerotiorum) без конідій – рис. 14;

б) наліт сірий пухнатий, із дрібними чорними склероціями; уражена тканина мокра, буруватого кольору; наліт містить довгі розгалужені конідієносці з овальними, безбарвними конідіями. Сіра гнилизна (Botrytis cinеrеa) – рис. 15;

в) наліт темно-сірий, пухнатий із чорними голівками, уражена тканина не змінює кольору, мокра, спори овальні, безбарвні. Сіра цвіль (Rhizopus nigricans) – рис. 16.

 

г)на ураженій тканині нальоту немає; тканина має вигляд слизової маси, що містить бактерії. Мокра бактеріальна гнилизна (Erwinia carotovora) – рис.17.

 

            а                                        б                    в

Рис. 14. Біла гнилизна моркви    (а), полуниці (б) та капусти (в)– ураження грибом Sclerotinia sclerotiorum

 

            а                               б                               в

Рис. 15 Botrytis cinеrеa (а-мікрофотографія, б та в-уражені ягоди відповідно суниці та винограду зовнішній вигляд)

 

 

  

              а                     б                               в                     г

Рис. 16. Rhizopus nigricans (а-мікрофотографія, уражені б-персик, в-суниця, г-сливи )

 

              а                     б                               в                     г

Рис. 17. Erwinia carotovora (а-мікрофотографія, уражені б-цибуля, в-перець, г-капуста )

 

Цибуля й часник

Гнилизна денця, уражена поверхня з нальотом:

а) на дінці біла грибниця, коріння цибулини згнивають, на розрізі тканини водянисті, м'які, наліт складається з міцелію й серпоподібних спор з перегородками. Гнилизна денця (Fusarium oxysporum) – рис. 9;

б) наліт сірий, пухнатий, частіше на внутрішніх лусочках і боковій частині цибулини; тканини шийки розм'якшуються, на розрізі вони жовтувато-рожеві, водянисті, наліт складається з безбарвних овальних спор, зібраних у голівки на розгалужених конідієносцях. Шийкова (сіра) гнилизна (Botrytis allii).

в) наліт чорний, цвілеподібний, плями погано виражені; конідії чорні, округлі, бородавчасті; при зберіганні вся цибулина перетворюється на чорну порошисту масу. Чорна цвіль (Aspergillus niger) – рис. 18;

г) наліт зелений, цвілеподібний; конідієносці з розгалуженими верхівками, що несуть ланцюжки округлих, дрібних, безбарвних конідій. Зелена цвіль (Penicillium) – рис. 19.

уражена тканина без нальоту:

а) ослизнення на лусочках цибулини – жовтувата або рожева гнилизна, цибулина неприємно пахне. Мокра бактеріальна гнилизна (Erwinia carotovora) – рис.17.

б) мокрі плями, уражені всі тканини, мають вигляд кашкоподібної маси з неприємним запахом; на межі хворої й здорової тканини – темна облямівка. Мокра бактеріальна гнилизна (Pseudomonas xanthochlora) рис.20

 

              а                     б                               в                     г

Рис.19. Зелена цвіль (а-мікрофотографія, уражені Penicillium б-часник, в-лимон,г-яблуко)

 

              а                     б                               в                     г

Puc. 18. Aspergillus niger (а-мікрофотографія, уражені б-цибулина, в-суниця, г-яблуко )

 

            а                                                  б                     в

Рис.20. Мокра гнилизна Pseudomonas xanthochlora, уражені картопля (а), часник (б) та томат.

Капуста

На гниючих качанах наліт грибниці:

а) наліт сірий, пухнатий зі спор і міцелію, склероції дрібні (0,1 – 0,7 см), чорні; на розгалужених конідієносцях дрібні овальні конідії. Сіра гнилизна (Botrytis cinerea) – рис. 15;

б) наліт темно-сірий з темними голівками (спорангії), спори
 круглі з товстою оболонкою. Сіра цвіль (Rhizopus nigricans) – рис. 16; в) наліт білий, щільний, пластівчастий із чорними склероціями розміром до 3 см; наліт тільки з міцелію. Біла гнилизна (Sclerotinia sclerotiorum) – рис. 14.

На гниючих кінчиках нальоту немає, качан ослизняється, неприємно пахне; в ураженій тканині маса бактерій. Слизовий бактеріоз (Erwinia carotovora) – рис.17.

Уражений качан або хвороба починається з нього: суха гнилизна качана, уражена тканина порохнява, іноді качани порожні, на поверхні листів бурі або сіруваті плями з пікнидами у вигляді чорних крапок, спори виходять із пікнид вузькою стрічкою. Фомоз (Phoma) – рис. 12.

Огірки та перці

 На плодах плями:

а) плями різної величини, втиснені, із чорно-маслиновим бархатистим нальотом; спори яйцеподібні, темнозабарвлені або двоклітинні. Маслинова плямистість (Cladosporium cucumerinum) – рис. 21;

 

                         

              а                                                           б      

Puc.21. Cladosporium cucumerinum (а-мікрофотографія, б-уражені огірки)

 

  

                       а                               б                               в

Puc. 22. Colletotrichum lagenarium (а-мікрофотографія, б і в-уражені відповідно гарбуз та огірок)

 

б) плями жовті, подовжені, втиснені з рожево-жовтими подушечками, спори яйцеподібні, одноклітинні, безбарвні. Антракноз (Colletotrichum lagenarium) – рис. 22;

в) на ураженій тканині білий пластівчастий наліт з міцелію, спороносіння відсутнє; на міцелії - чорні великі склероції. Біла гнилизна (Sclerotinia sclerotiorum) – рис. 14;

г) наліт сірий, пухнатий, із чорними дрібними склероціями, спори овальні, одноклітинні, безбарвні. Сіра гнилизна (Botrytis cinеrеa) – рис. 15.

Помідори

На плодах плями:

а) плями розпливчасті, бурі, з білим нальотом гриба, спори округлі, безбарвні. Фітофтороз (Phytophtora infestans) – рис. 6;

б) плями округлі, втиснені, із чорним нальотом, спори темні з довгим придатком, поперечними й поздовжніми перегородками. Макроспоріоз (Alternaria solani) – рис. 23;

в) ураження починається в місцях прикріплення плода до плодоніжки. Поступово поверхня плода стає чорною. Чорна гнилизна, або диплодінос (Diplodina destructive) – рис. 24.

 

                       а                               б                    в

Puc. 23. Alternaria solani (а-мікрофотографія, б-ураженй плід перцю, в-уражена гілка томатів)

 

              а                б                               в

Pис. 24. Diplodina destructive (а-мікрофотографія, б-розвиток міцелію, в-ураженй уражений кущ перцю)

 

Яблука й груші

На поверхні плодів:

а) бурі плями концентричними колами. М'якоть бурувато-коричнева (Monilia fructigena) – рис. 25;

б) бурі плями із дрібними чорними горбками, розташовані колами (Sphaеropsis malorum) – рис. 26;

              а                    б                     в                     г

Puc. 25. Monilia fructigena (а-мікрофотографія, б-уражені ягоди черешні, в,г-уражені груша та яблука)

 

              а                                        б                                   в

Puc. 26. Sphaеropsis malorum (а-мікрофотографія, б-уражені ягоди винограду, в-уражене яблуко)

 

в) плями зелені, зеленувато-сині, сіро-зелені (Penicillium expansum) рис. 19;

г) плями рожевого кольору, часто вражається насінева камера (Trichothecium roseum) – рис. 27.

                  

                       а                                                           б      

Рис. 2. Trichothecium roseum(а-мікрофотографія, б-уражене яблуко)

 

Цитрусові

а) на розм'якшених плодах біла пластівчаста грибниця, із чорними неправильної форми склероціями до 1 – 3 см величиною, спороносіння відсутнє. Біла гнилизна (Sclerotinia sclerotiorum) – рис. 14;

б) на плодах м'яка водяниста, злегка втиснена, зморщена шкірочка, на поверхні грибниця, що утворює вузьку білу облямівку навколо блакитного нальоту спор; спори ланцюжками, яйцеподібні, гладкі. Блакитна цвіль (Penicillium) рис. 19;

в) гнила тканина розм'якшена, водяниста, легко продавлюється; на поверхні рясна поверхнева грибниця з маслиново-зеленим нальотом спороносіння; спори розташовані ланцюжками, округлі. Маслиново-зелена цвіль (Penicillium) рис. 19.

г) на плодах бурі язви, спочатку світлі а зі збільшенням в розмірах темніють у разі проникнення до соковитої серцевини плоду викликають втрату вологи і затвердіння. Уражуються здебільшого апельсини та мандарини (солодкі плоди). Збудник захворювання Alternaria radacina рис. 13.

Завдання на виконання

1.   Провести фітопатологічне обстеження ураженої сировини: Описати й замалювати зовнішній вигляд уражень на плодах і овочах. Описати й замалювати зовнішній вигляд уражень на зрізі. Визначити збудників захворювання мікроскопуванням. Зробити фіксовані препарати бактерій і препарати грибів методом "роздавлена крапля". Замалювати. Пересіяти гриби на тонку пластинку поживного середовища.

2. Провести посів сировини для виготовлення консервів (капусти, моркви, картоплі, грибів, яблук, буряку тощо) на МПА для визначення МАФАМ та на солодовий агар з крейдою для визначення молочнокислих бактерій). Для цього з середньої проби на стерильну, попередньо зважену, чашку Петрі, взяти наважку 5 г, яку потім розмішати у колбі з 90 см³ води та піском (піску – 2 – 3 г). Колбу протягом 10 хвилин збовтувати рухами по колу.

З одержаної суспензії приготувати розведення: 10⁴  – для овочів, 10² – для яблук. На чашки Петрі висіяти 1 см³ суспензії відповідного розведення і розподілити її по поверхні середовища за допомогою шпателя Дригальського. Потім чашки інкубувати при t=30 ^о С протягом 48 – 72 годин.

Аналіз одержаних результатів:

1. Користуючись навчальним визначником, встановити збудника вражень картоплі, овочів і плодів і скласти висновок.

2. На наступному лабораторному занятті виконати облік бактеріальної забрудненості сировини для виготовлення консервів. Результати досліджень занести у таблицю 3:

Таблиця 3

Об’єкт дослідження	Ступінь розведення	Кількість колоній на чашці Петрі			Кількість мікроорганізмів у 1 г сировини	Примітка
		Бактерії	Гриби	Загальна

За одержаними результатами зробити висновки та записати їх у протокол.

 

Контрольні запитання

1. Що таке фітопатогенні мікроорганізми?

2. Чим епіфітна мікрофлора плодів та овочів відрізняється від фітопатогенної? Відповідь проілюструйте прикладами.

3. Які методи викорисовуються при фітопатологічному аналізі?

4. Як впливають на ураження фітопатогенними мікроорганізмами умови зберігання плодів і овочів?

5. Чому підвищена температура й вологість провокують захворювання плодів і овочів?

6. Які методи мікробіологічного контролю сировини використовуються у промисловості?

7. Яке завдання має мікробіологічний контроль сировини консервного виробництва?

8. Які заходи щодо зниження мікробної контамінації плодів і овочів застосовуються у промислових умовах?

 

Лабораторна робота 4