Липоксигеназа зародышей пшеницы и ее свойства

Липоксигеназа (линолеат: кислород-оксидоредуктаза, КФ 1.13.11.12) – фермент класса диоксигеназ, катализирующий окисление полиненасыщенных жирных кислот и их эфиров молекулярным кислородом с получением перекисей. Процессу окисления подвергаются участки молекул жирных кислот, имеющих цис, цис- 1, 4-пентадиеновые фрагменты [41, 43, 192, 434].

Перекиси, возникающие под влиянием липоксигеназы, имеют значительную реакционную способность и приводят к появлению постороннего неприятного вкуса и запаха в ЗП [353, 393, 399, 400, 406, 413, 440, 444].

 Считается, что механизм реакции окисления полиненасыщенных жирных кислот молекулярным кислородом, катализируемой липоксигеназой, согласуется с законами свободно-радикального цепного окисления липидов. Как и значительная часть ферментов, регулирующих реакции между молекулярным кислородом и органической молекулой, липоксигеназа имеет в своем составе переходный металл (железо). Известно, что кислород находится в триплетном состоянии (бирадикал, имеющий два неспаренных электрона), а устойчивые органические молекулы, принимающие участие в реакции, катализируемой липоксигеназой, находятся в синглетном состоянии (их электроны спарены). Непосредственная реакция между триплетной молекулой и синглетной с получением синглетных продуктов затруднена. В теории эта трудность преодолевается при переводе кислорода из его триплетного основного состояния в синглетное. Но это требует расхода колоссального количества энергии, а энзимы не поставляют электронную энергию в таких масштабах. Решение данной проблемы, полученное в процессе эволюции у оксигеназ, заключается в том, чтобы скомплексировать триплетный кислород со связанным ферментом переходным металлом, который сам имеет неспаренные электроны. Образовавшийся при этом комплекс может вступать в реакцию с синглетным органическим соединением с получением синглетных окислительных продуктов. Наличие железа в ионной форме доказывает то, что липоксигеназа применяет такой вариант решения проблемы. Образующиеся радикалы полиненасыщенных жирных кислот далее активно реагируют с кислородом, образуя перекисные радикалы, которые реагируют со следующей молекулой жирной кислоты с получением свободного радикала и накоплением перекисей и гидроперекисей [41, 43, 192, 445].

Особенность свободно-радикального окисления в том, что цепная реакция при наличии металлов с переменной валентностью становится разветвленной, так как продукты реакции цепного окисления ‑ гидроперекиси распадаются с получением свободных радикалов, образующих новые цепи окисления.

Известно, что в семенах растений липоксигеназа выполняет также и защитную функцию, поддерживая содержание кислорода на низком уровне и утилизируя посредством анаэробных реакций те гидроперекиси, которые являются продуктами реакции аутоокисления. При повреждении растений активность липоксигеназы увеличивается в несколько раз и высвободившаяся энергия при окислении преобразуется в теплоту.

Установлено, что температурный оптимум липоксигеназы ЗП равен 30 ^оС, а оптимум рН составляет 7,0 [101, 434, 445]. Кислотная и термическая инактивациялипоксигеназы ЗП свидетельствует, что наибольшую стабильность липоксигеназа имеет при рН 8,0 и температуре 20 ^оС. Константы скорости инактивациилипоксигеназы ЗП, характеризующие снижение активности, приходящейся на единицу активности фермента за один час, приведены в таблице 3.2.

Таблица 3.2

Константы скорости инактивации липоксигеназы зародышей пшеницы

Температура, ^оС	К (ч^-1) при рН
	4,0	5,0	6,0	7,0	8,0
20	6,14	4,04	3,37	2,99	2,31
30	23,80	15,70	10,50	8,10	6,50
40	105,10	58,30	39,40	22,74	19,32
50	251,80	161,40	114,90	92,87	73,70
60	664,30	480,50	382,80	352,90	287,60

 

Из данных таблицы 3.2следует, что увеличение температуры с 20до 40 и выше^оС приводит к повышению средних значений констант скорости термической инактивации на порядок и выше. Выяснено, что в активный центр липоксигеназы ЗП входят имидазольная группа гистидина и НО–СН₂–группа серина, ионы железа.

Первым этапом окисления цис, цис-1,4-пентадиенового участка ненасыщенной жирной кислоты является отсоединение водородного иона. Донором иона водорода считается СН₂-группа участка, более слабо с энергетической точки зрения удерживающая водородные атомы, чем цис-двойная связь. Образующийся на пентадиеновом участке радикал -С₃-Н стимулирует преобразование этого комплекса в резонирующую структуру и передвижение неспаренного электрона от радикала -С₃-Н к группе -С₁-Н. В процессе этих преобразований цис, цис-1,4-пентадиеновый участок полиненасыщенной жирной кислоты преобразуется в транс, цис-форму. Ввиду того, что образующаяся у С₂ и С₃ – атомов транс-двойная связь считается более энергетически выгодной, чем цис-связь, ее возникновение вносит определенный энергетический вклад в образование радикала -С₁-Н. 

Данные преобразования в пентадиеновом участке позволяют присоединить молекулярный кислород с возникновенимперекисного радикала-С₁-О-О. Известно, что молекулярный кислород считается достаточно инертным. Под влиянием липоксигеназы он подвергается активации. Скорее всего, атом железа липоксигеназы в форме Fe³⁺ создает комплекс с молекулярным кислородом. Активация молекулярного кислорода способствует его акцептированию радикалом С₁-Н-R–функциональной группы липоксигеназы, связывающая ион Fe³⁺. В процессе этой реакции возникает перекисная форма пентадиенового фрагмента жирной кислоты. Получение гидроперекиси является последней стадией окисления жирных кислот. К радикалу Н-С₁-О-О присоединяется ион водорода. Так как рН_оплипоксигеназы равен 7,0, скорее всего, донором иона является протонированная система Ser-OH×××Н⁺ Im-His. Итак, система Ser-CH₂-O×××H×××Im-His в активном центре липоксигеназы переходит в начальную стадию. В процессе ферментативного окисления ненасыщенных жирных кислот липоксигеназа выполняет челночную функцию [90, 91, 89, 330].