Вопрос 19. Репликация ДНК (полуконсервативный механизм)

Синтез ДНК в подавляющем большинстве случаев проходит по полуконсервативному механизму, то есть дочерняя цепь ДНК синтезируется по материнской цепи, называемой обычно матрицей. В одних случаях матрицами являются односпиральные ДНК, в других - РНК.

Репликация, редупликация, ауторепродукция, протекающий во всех живых клетках процесс самовоспроизведения нуклеиновых кислот, генов, хромосом.

Репликация ДНК — это процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты, который происходит в процессе деления клетки на матрице родительской молекулы ДНК. При этом генетический материал, зашифрованный в ДНК, удваивается и делится между дочерними клетками. Репликацию ДНК осуществляет фермент ДНК-полимераза.

В основе механизма репликация лежит ферментативный синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновых кислот (РНК), осуществляемый по матричному принципу. Строгая специфичность спаривания азотистых оснований в молекуле ДНК обусловливает комплементарность последовательностей оснований в двух цепях и обеспечивает высокую точность Репликация Пары гуанин — цитозин стабилизируется тремя водородными связями, пара аденин — тимин — двумя. Согласно Уотсону и Крику, процесс Репликация ДНК предусматривает: 1) разрыв водородных связей и расплетение нитей двойной спирали; 2) синтез на одиночных нитях комплементарных цепей. В результате из одной двухцепочечной ДНК возникают две подобные молекулы, причём в каждой из дочерних молекул одна полинуклеотидная цепь родительская, а другая — синтезированная заново (полуконсервативный механизм Репликация).

У вирусов и фагов, имеющих однонитевую ДНК, Репликация идёт особым образом. После внедрения в клетку хозяина одноцепочечной ДНК, которую называют (+)-цепью, на ней, как на матрице, синтезируется комплементарная ей (—)-цепь. На образовавшейся двухспиральной молекуле (репликативная форма) синтезируются новые одноцепочечные (+)-цепи, включающиеся в новые вирусные частицы. По такому же принципу происходит Репликация РНК-содержащих вирусов и фагов.

У высших организмов — эукариотов, клетки которых содержат сформированное ядро, основную генетическую функцию несут сложно организованные структуры — хромосомы, состоящие из ДНК, РНК, белков и других веществ. В интерфазе, предшествующей делению клеток, осуществляется Репликация ДНК и других компонентов хромосом; затем удвоенные хромосомы разъединяются и распределяются равномерно между дочерними клетками. Т. о., вся наследственная информация в относительно неизмененном виде передаётся от клетки к клетке, от поколения к поколению.

Хеликаза, топоизомераза и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Репликация у эукариот осуществляется несколькими разными ДНК-полимеразами. Далее происходит закручивание синтезированных молекул по принципу суперспирализации и дальнейшей компактизации ДНК. Синтез энергозатратный.

Цепи молекулы ДНК расходятся, образую репликационную вилку, и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две новые двуспиральные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле.

Каждая молекула ДНК состоит из одной цепи исходной родительской молекулы и одной вновь синтезированной цепи. Такой механизм репликации называется полуконсервативным.

 Процесс репликации ДНК

Репликация состоит из большого числа последовательных этапов, которые включают узнавание точки началу репликации, расплетание исходного дуплекса (спирали), удержание его цепей в изолированном друг от друга состоянии, инициацию синтеза на них новых дочерних цепей, их рост (элонгацию), закручивание цепей в спираль и терминацию (окончание) синтеза. Функциональная единица репликации – репликон, представляющий собой сегмент (участок) хромосомы или внехромосомной ДНК, ограниченный точкой начала, в которой инициируется репликация, и точкой окончания, в которой репликация останавливается. Скорость репликации контролируется на стадии инициации. Однажды начавшись, репликация продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплицирован (удвоен). В каждом клеточном цикле репликация инициируется только один раз. Начиная с точки инициации, репликация осуществляется в ограниченной зоне, перемещающейся вдоль исходной спирали ДНК. Эта активная зона репликации (т.н. репликац. вилка) может двигаться в обоих направлениях. При однонаправленной репликации вдоль ДНК движется одна репликационная вилка. При двунаправленной репликации от точки инициации в противоположных направлениях расходятся две репликационные вилки; Движение двух вилок в противоположных направлениях создает петлю, которая имеет вид "пузыря" или "глаза". Продолжающаяся репликация расширяет "глаз" до тех пор, пока он не включит в себя весь репликон.

В ходе репликации рост цепи осуществляется благодаря взаимодействию дезоксирибонуклеозидтрифосфата с 3'-ОН концевым нуклеотидом уже построенной части ДНК; при этом отщепляется пирофосфат и образуется фосфодиэфирная связь. Рост полинуклеотидной цепи идет только с ее З'-конца, т. е. в направлении 5': 3'. Фермент, катализирующий эту реакцию, -ДНК – полимераза.

ДНК-полимераза имеет один центр связывания нуклеозидтрифосфата, общий для всех четырех нуклеотидов.

Репликационная вилка асимметрична. Из двух синтезируемых дочерних цепей ДНК одна строится непрерывно, а другая – с перерывами. Первую называют ведущей, или лидирующей, цепью, а вторую – отстающей. Синтез второй цепи идет медленнее; Благодаря такому прерывистому механизму синтеза, репликация обеих антипараллельных цепей осуществляется с участием одного фермента-ДНК-полимеразы, катализирующего наращивание нуклеотидной цепи только в направлении 5': 3'.

В качестве затравок для синтеза фрагментов отстающей цепи служат короткие отрезки РНК, комплементарные матричной цепи ДНК. Эти РНК-затравки (праймеры), состоящие примерно из 10 нуклеотидов, с определенными интервалами синтезируются на матрице отстающей цепи из рибонуклеозидтрифосфатов в направлении 5': 3' с помощью фермента РНК-праймазы. РНК-праймеры затем наращиваются дезоксинуклеотидами с 3'-конца ДНК-полимеразой, которая продолжает наращивание до тех пор, пока строящаяся цепь не достигает РНК-затравки, присоединенной к 5'-концу предыдущего фрагмента.

Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З'-ОН нового фрагмента ДНК и 5'-фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, к-рая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента-никотинамид-адениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов).

Геликазы расплетают короткие участки ДНК, находящиеся непосредственно перед репликационной вилкой. На разделение каждой пары оснований расходуется энергия гидролиза двух молекул АТФ до аденозиндифосфата и фосфата. К каждой из разделившихся цепей присоединяется несколько молекул ДНК-связывающих белков, которые препятствуют образованию комплементарных пар и обратному воссоединению цепей.

В случае кольцевого репликона (напр., у плазмиды) описанный процесс наз. q-репликацией. Кольцевые молекулы ДНК закручены сами на себя (суперспирализованы), при раскручивании двойной спирали в процессе репликации они должны непрерывно вращаться вокруг собственной оси. При этом возникает торсионное напряжение, которое устраняется путем разрыва одной из цепей. Затем оба конца сразу же вновь соединяются друг с другом. Эту функцию выполняет фермент ДНК-топоизомераза. Репликация в этом случае обычно происходит в двух направлениях, т.е. существуют две репликационные вилки.

Альтернативный вариант репликации кольцевого репликона предполагает разрыв в одной из цепей двухспиральной молекулы ДНК. Образовавшийся при этом свободный 3'-конец ковалентно наращивается, оставаясь связанным с матрицей (второй, неразорванной цепью), а 5'-конец постепенно вытесняется новой полинуклеотидной цепью. Таким образом одна цепь разматывается и непрерывно удлиняется, а репликационная вилка скользит вокруг кольцевой матричной цепи (механизм "катящегося кольца"). По мере роста новой цепи вытесненная цепь с освободившимся 5'-концом становится линейной матрицей для синтеза новой комплементарной цепи.

Известно несколько типов репликации, РНК:

1. вирусы, содержащие матричные РНК, или мРНК [т. наз. (+)РНК], в результате репликации образуют комплементарную ей цепь [(-)РНК], не являющуюся мРНК, которая используется как матрица для синтеза (+)РНК;

2. вирусы, содержащие (—)РНК, в результате репликации синтезируют (+)РНК;

3. вирусы, содержащие двухцепочечную РНК [(+)PHK и (—)РНК], в результате асимметрической репликации синтезируют (+)РНК.

Гипотеза о механизме репликации сформулирована в 1953 Дж. Уотсоном и Ф. Криком, которые предположили, что две комплементарные цепи ДНК после их разделения могут выполнять функции матриц для образования на них новых цепей ДНК.